張新寶， 姚 超， 洪青青， 韓波波， 方雪暉

結(jié)核性腦膜炎（TBM）是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的腦膜、脈絡(luò)叢和室管膜的非化膿性炎性反應(yīng)，是常見的肺外結(jié)核。因其早期缺乏特異的臨床表現(xiàn)及體征，臨床診斷困難，死亡率、致殘率顯著高于其他肺外結(jié)核[1]。隨著耐藥結(jié)核菌及人類免疫缺陷病毒（HIV）感染的增加，TBM的發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)[2]。在結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家中，44%～69%TBM患者未得到及時(shí)有效的診治而死亡[3]。腦脊液培養(yǎng)或腦脊液抗酸桿菌（AFB）涂片見結(jié)核分枝桿菌，是診斷TBM的常規(guī)手段，但其耗時(shí)長(zhǎng)，靈敏度低，不能滿足對(duì)TBM的早期診斷[4]。隨著外周血結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB）在結(jié)核病診斷中的廣泛開展，其對(duì)肺結(jié)核及肺外結(jié)核檢測(cè)均具有較高的靈敏度和特異度[5]。本研究通過對(duì)安徽省胸科醫(yī)院收治的93例腦膜炎患者進(jìn)行外周血T-SPOT.TB檢測(cè)，探究其對(duì)TBM的診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

2017年1月－2019年12月本院收治的93例腦膜炎患者，檢測(cè)外周血T-SPOT.TB、腦脊液腺苷脫氨酶（ADA）、腦脊液結(jié)核分枝桿菌DNA（TBDNA）、腦脊液AFB涂片，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分 析。

1.2 TBM診斷標(biāo)準(zhǔn)

確診標(biāo)準(zhǔn)[6]：①腦脊液結(jié)核核酸檢測(cè)陽性；②腦脊液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)或腦脊液AFB涂片陽性。臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)：①臨床診斷為TBM，抗結(jié)核治療有效；②腦脊液真菌、細(xì)菌學(xué)、寄生蟲或腫瘤檢查陰性，腦脊液常規(guī)、生化指標(biāo)顯示細(xì)胞數(shù)為（0.01～0.50）×109/L，單核細(xì)胞占比＞50%，蛋白＞1 g/L；③頭顱磁共振顯示顱底腦膜強(qiáng)化或腦積水表現(xiàn)；④有低熱、盜汗等典型結(jié)核臨床癥狀。

1.3 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

所有入組患者均簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡＞18周歲；臨床表現(xiàn)有發(fā)熱、頭疼、嘔吐、頸強(qiáng)直、意識(shí)改變、昏睡、局部神經(jīng)損害等一項(xiàng)或多項(xiàng)癥狀或體征。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有腦疝征象者；②HIV感染，或凝血功能嚴(yán)重障礙者；③影像學(xué)表現(xiàn)為顱內(nèi)占位性病變，顱內(nèi)壓增高明顯者；④腰穿部位的皮膚和軟組織有嚴(yán)重感染者；⑤休克或嚴(yán)重全身感染，或躁動(dòng)不安者。

1.4 檢驗(yàn)方法

1.4.1 外周血T-SPOT.TB 試劑采用英國(guó) OXFORD公司的T-SPOT.TB，采集外周血10 mL，6 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，通過對(duì)T-SPOT.TB基因序列差異區(qū)1（RD1）編碼的特異性抗原T淋巴細(xì)胞檢測(cè)，以相對(duì)分子量為6 000的早期分泌靶抗原A（ESAT-6）和相對(duì)分子量為10 000的濾液蛋白抗原B（CFP-10）作為特殊抗原。將外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）放入含有γ干擾素抗體的平板，分析儀計(jì)算每孔的斑點(diǎn)數(shù)。依據(jù)T-SPOT.TB產(chǎn)品說明書的判斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行判斷[7]，以每孔0～6個(gè)斑點(diǎn)數(shù)作為陰性對(duì)照，當(dāng)檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)-陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6時(shí)，視為陽性；若陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù) ≥6時(shí)，檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)≥2倍的陰性孔視為陽 性。

1.4.2 腦脊液ADA檢測(cè) 采集腦脊液1～2 mL，以3 000～3 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心10～15 min，取標(biāo)本上清液進(jìn)行ADA檢測(cè)，儀器采用北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的全自動(dòng)分析儀，試劑采用北京利德曼生化股份有限公司生產(chǎn)的ADA試劑，采用過氧化物酶法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行分析。以腦脊液ADA＞7.5 U/L視為陽性標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.3 腦脊液TB-DNA檢測(cè) 采集腦脊液1～2 mL，用洗滌劑進(jìn)行液化洗滌，以去除腦脊液中的蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)。依據(jù)核酸試劑提供的說明書，“分枝桿菌核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程”向核酸提取管中加入50 μL核酸提取液，加入處理后的腦脊液標(biāo)本，5 000 r/min離心1 min，24 h內(nèi)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增反應(yīng)。嚴(yán)格遵守《臨床技術(shù)操作規(guī)范（結(jié)核病分冊(cè)）》進(jìn)行檢測(cè)[8]。采用廣州迪澳生物科技有限公司試劑及儀器。

1.4.4 腦脊液AFB涂片 無菌收集腦脊液1～2 mL，以6 000～8 000 r/min離心20 min，棄上清液，取沉淀物在經(jīng)95%乙醇處理過的干燥、清潔、無劃痕的新玻片上，均勻涂抹成2 cm×2.5 cm薄膜，自然干燥，光學(xué)顯微鏡檢。操作嚴(yán)格遵守《臨床技術(shù)操作規(guī)范（結(jié)核病分冊(cè)）》。試劑購(gòu)自廣州迪澳生物科技有限公司，儀器采用OLYMPUS CX21光學(xué)顯微鏡。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將取得的數(shù)據(jù)逐條納入Excel表格，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料比較采用卡方（χ2）檢驗(yàn)，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)）表示。正態(tài)分布的組間采用t檢驗(yàn)；以受試者工作特征（ROC）曲線及曲線下面積（AUC）來分析不同試驗(yàn)方法的診斷價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組腦膜炎患者基礎(chǔ)資料比較

93 例腦膜炎患者，男58例，女 35 例；平均年齡（57.0±3.9）歲。TBM 62例，非TBM 31例；TBM組中，確診病例17例，臨床診斷病例45例；非TBM組患者中，病毒性腦膜炎20例，化膿性腦膜炎10例，隱球菌腦膜炎1例。TBM與非TBM組性別及年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。TBM組的腦脊液淋巴細(xì)胞分類、ADA均明顯高于非TBM組（P＜0.05），有核細(xì)胞計(jì)數(shù)、糖及氯化物水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞?0.05）。見表1。

表1 TBM組與非TBM組腦脊液檢查結(jié)果Table 1 Cerebrospinal fluid test results of tuberculous meningitis versus non-tuberculous meningitis

2.2 4種檢測(cè)方法結(jié)果比較

外周血T-SPOT.TB、腦脊液ADA、腦脊液TB-DNA及腦脊液AFB檢測(cè)，對(duì)TBM組的診斷陽性率均高于非TBM組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以外周血T-SPOT.TB陽性率最高（82.3%），腦脊液AFB檢測(cè)陽性率最低（16.1%）。見表2。

表2 外周血T-SPOT.TB、腦脊液ADA、腦脊液TB-DNA和腦脊液AFB涂片對(duì)結(jié)核性腦膜炎檢測(cè)陽性結(jié)果Table 2 Positive rate of peripheral blood T- SPOT.TB versus ADA， TB-DNA and AFB smear in CSF in detecting tuberculous meningitis

2.3外周血T-SPOT.TB檢測(cè)與其他3種檢測(cè)技術(shù)比 較

外周血T-SPOT.TB檢測(cè)在臨床診斷TBM組中診斷靈敏度（80.0%，36/45 ）明顯高于腦脊液ADA（55.6%，25/45）、TB-DNA（0，0/45）、AFB涂片（0，0/45）（χ2值分別為6.16、60.00、60.00，P＜0.05）；外周血T-SPOT.TB檢測(cè)在確診病例中靈敏度為（88.2%，15/17），明顯高于腦脊液ADA（76.5%，13/17）、AFB涂片（58.8%，10/17）。外周血T-SPOT.TB總體檢測(cè)的靈敏度（82.3%，51/62），明顯高于腦脊液ADA（61.3%，38/62）、TB-DNA（27.4%，17/62）、AFB涂片（16.1%，10/62），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2值分別為6.73、37.64、54.24，P＜0.01）。見表3。

表3 外周血T-SPOT.TB檢測(cè)與腦脊液ADA、TB-DNA、AFB檢測(cè)結(jié)果Table 3 Performance of peripheral blood T- SPOT.TB versus ADA， TB-DNA， and AFB in CSF[%（n / n）]

2.4 4種檢測(cè)結(jié)果ROC曲線分析

對(duì)檢測(cè)結(jié)果采用ROC曲線分析，來判斷外周血T-SPOT.TB在TBM中的診斷價(jià)值。外周血T-SPOT.TB、腦脊液ADA、腦脊液TB-DNA和腦脊液AFB涂片的AUC值分別為0.815、0.661、0.637和0.581。T-SPOT.TB檢測(cè)AUC值最高，為0.815（95%CI：0.717～0.912）。見圖1。

圖1 4種檢測(cè)方法ROC曲線分析Figure 1 Receiver operating characteristic （ROC） curve analysis of four testing methods

3 討論

TBM是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病，是常見肺外結(jié)核中最嚴(yán)重的類型[9]，致殘率及病死率高?？咕幬锘蚣に氐牟灰?guī)范使用，致使典型TBM癥狀、體征越發(fā)不明顯，常與化膿性腦膜炎、病毒性腦膜炎及隱球菌腦膜炎等相混淆[10]。腦脊液AFB涂片或結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)是診斷TBM的金標(biāo)準(zhǔn)，而腦脊液AFB涂片陽性檢測(cè)率低（10%～60%）[11]，腦脊液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)（4～6周）[12]，對(duì)早期TBM的診斷意義不大。臨床實(shí)踐過程中發(fā)現(xiàn)，TBM的確診往往比較困難，T-SOPT檢測(cè)對(duì)TBM的診斷具有較高的靈敏度及特異度[13]，可作為輔助診斷的參考指標(biāo)之一。

外周血T-SPOT.TB檢測(cè)是采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)，測(cè)定結(jié)核分枝桿菌在特異性抗原刺激下，外周血γ干擾素釋放效應(yīng)T細(xì)胞的數(shù)量。使用結(jié)核分枝桿菌RD1基因編碼，以相對(duì)分子量為6 000的ESAT-6和相對(duì)分子量為10 000的CFP-10作為特異性抗原[14]。T-SPOT.TB在單細(xì)胞水平檢測(cè)，能及時(shí)捕獲細(xì)胞周圍分泌的細(xì)胞因子，不受機(jī)體免疫狀態(tài)和卡介苗接種的影響，具有較高的靈敏度和特異度[15]。該方法越來越多應(yīng)用于臨床結(jié)核病的診斷中[16]。劉紅等[17]通過對(duì)收治的1 084例疑似肺結(jié)核的研究發(fā)現(xiàn)，T-SPOT.TB診斷疑似結(jié)核病的靈敏度為86.2%（331/384）、特異度為91.1%（638/700），明顯高于結(jié)核菌素試驗(yàn)。Patel等[18]通過對(duì)150例疑似TBM的研究發(fā)現(xiàn)，TBM外周血T細(xì)胞斑點(diǎn)反應(yīng)與腦脊液中T細(xì)胞反應(yīng)相似，外周血T-SPOT.TB診斷TBM的效能與腦脊液T-SPOT.TB診斷效能相似。本研究未對(duì)腦脊液T-SPOT.TB進(jìn)行送檢，或許考慮以下因素：①腦脊液取樣困難；②腦膜炎患者腦脊液T淋巴細(xì)胞含量少，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果；③成人腦脊液總量為120～150 mL，為避免腦疝、低顱壓性腦病等并發(fā)癥的發(fā)生，每次取腦脊液量有限制（4～6 mL），限制了腦脊液中T-SPOT.TB的檢測(cè)。

ADA是嘌呤核苷酸代謝的關(guān)鍵酶，在腦組織、胸腔、胸腺、脾臟均有廣泛分布。可能參與T淋巴細(xì)胞的活化。許茜等[19]通過對(duì)84例TBM及86例非TBM的患者研究發(fā)現(xiàn)，腦脊液ADA診斷結(jié)核性腦炎的靈敏度為65.48%，靈敏度及特異度較低，聯(lián)合外周血T-SPOT.TB檢測(cè)，能明顯提高疾病診斷效能，靈敏度達(dá)到82.1%。腦脊液ADA檢測(cè)受機(jī)體免疫功能影響，檢測(cè)結(jié)果波動(dòng)較大，常受到腫瘤、糖尿病、風(fēng)濕病的影響，出現(xiàn)假陰性結(jié)果[20]。腦脊液TB-DNA檢測(cè)采用核酸實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)，可能因核酸檢測(cè)試劑中含有內(nèi)源性抑制因子的殘留、標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌含量極少易出現(xiàn)假陰性[21]，且不同標(biāo)本陽性檢出率也不盡相同，腦脊液TB-DNA陽性檢出率為20%～30%，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道相似[22]。

本研究中，采用ROC曲線及其AUC來分析不同試驗(yàn)方法的診斷價(jià)值。外周血T-SPOT.TB、腦脊液ADA、腦脊液TB-DNA和腦脊液AFB涂片的AUC值分別為0.815、0.661、0.637和0.581。外周血T-SPOT.TB的AUC值明顯高于腦脊液ADA、腦脊液TB-DNA和腦脊液AFB涂片。外周血T-SPOT診斷TBM的靈敏度最高（82.3%，51/62），診斷效能優(yōu)于其他3種檢測(cè)方法。目前T-SPOT.TB細(xì)胞臨界值尚無明確界定，依據(jù)試劑盒推薦標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，有待于大樣本量的統(tǒng)計(jì)分析[23]。Kim等[24]研究發(fā)現(xiàn)，外周血T-SPOT.TB診斷TBM的靈敏度為71%（95%CI：51%～86%），特異度為57%（95%CI：42%～70%），聯(lián)合腦脊液ADA檢測(cè)，可明顯提高TBM診斷的特異度。本研究顯示，外周血T-SPOT.TB診斷TBM的靈敏度為82.3%、特異度為80.7%，高于Kim等[24]實(shí)驗(yàn)結(jié)果。分析原因可能為：①中國(guó)為結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家，我院為安徽省結(jié)核病定點(diǎn)收治醫(yī)院，來院就診的腦膜炎患者，外院往往懷疑為TBM，難以做到實(shí)際意義上的雙盲原則，致使檢測(cè)結(jié)果高于國(guó)外。②隨著年齡的增大，ADA分泌逐步下降[25]。③由于分級(jí)診療的逐步實(shí)施，腦膜炎患者大多曾在外院治療，不排除使用抗結(jié)核藥物及激素治療，導(dǎo)致體內(nèi)的激素水平出現(xiàn)變化，致使ADA出現(xiàn)假陰性。

本研究的不足之處是納入研究患者數(shù)量較少，缺乏有力的細(xì)菌學(xué)檢查依據(jù)，且大多數(shù)患者為臨床診斷病例，確診病例數(shù)量較少，未能進(jìn)行計(jì)數(shù)資料的χ2檢驗(yàn)，仍需大樣本及多中心研究驗(yàn) 證。

綜上所述，外周血T-SPOT.TB檢測(cè)技術(shù)具有較高靈敏度及特異度，結(jié)合患者典型的臨床癥狀、腦脊液常規(guī)、生化，可對(duì)TBM進(jìn)行臨床診斷，具有較高的輔助診斷價(jià)值。