徐 曉， 許 巍

鮑曼不動桿菌是一種機會致病菌，主要感染重癥患者及免疫力低下人群。鮑曼不動桿菌與其他革蘭陰性病原體相比感染率較低，但在全球范圍內(nèi)，約有45%該菌分離株具有多重耐藥性，拉丁美洲和中東地區(qū)的多重耐藥率高達70%。并且鮑曼不動桿菌的多重耐藥率比其他革蘭陰性病原體（如銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌）高出近4倍[1]。在重癥監(jiān)護室（ICU）鮑曼不動桿菌感染相關(guān)病死率高達45%～60%[2]。目前所用的抗菌藥物，如抗假單胞菌頭孢菌素、氟喹諾酮類、氨基糖苷類、碳青霉烯類和替加環(huán)素對該菌的作用有限。因此需要深入了解細菌的毒力因子和耐藥機制，找尋新的可替代的治療方法。鐵離子是鮑曼不動桿菌生長所必須的金屬離子，鐵的吸收能增強菌株的致病性和毒力，細胞內(nèi)鐵離子濃度低于10-6mol/L時稱為鐵饑餓現(xiàn)象[3]，不利于細菌生存，人體內(nèi)游離鐵離子濃度通常不能滿足細菌生長需求，為了抵抗這種惡劣壞境，細菌衍生出了許多直接或者間接的機制來獲取鐵離子。在鮑曼不動桿菌中，可以通過亞鐵離子轉(zhuǎn)運（Feo）系統(tǒng)攫取Fe2+，也可在高親和力螯合劑幫助下攫取鐵離子，或者通過分泌一種攝取血紅素的蛋白來間接攫取鐵，有研究顯示，在低鐵條件下，鮑曼不動桿菌會修飾一系列鐵離子相關(guān)基因以及生物膜形成、呼吸、動力等相關(guān)過程的基因表達來抵抗低鐵環(huán)境，因此鐵離子是鮑曼不動桿菌生存與毒力作用的因素之一[4]。如果能從機制入手，研發(fā)出相關(guān)藥物或者疫苗，徹底破壞鮑曼不動桿菌對鐵的獲取，使得菌體缺乏必須的營養(yǎng)元素，從而有效阻止細菌生長。本文主要綜述幾種重要的鐵轉(zhuǎn)運機制及其相關(guān)應(yīng) 用。

1 Fe3+載體

鮑曼不動桿菌為需氧革蘭陰性桿菌，鐵離子的獲取主要依靠鐵載體和血紅素的主動轉(zhuǎn)運。在鮑曼不動桿菌中鐵載體主要有三種：不動桿菌素（acinetobactin）、絲膜蛋白（fimsbactin）、鮑曼鐵蛋白（baomannoferrion）。不動桿菌素[5]和絲膜蛋白A-F[6]首次報道于1994和2013年，經(jīng)過非核糖體肽合成酶（nonribosomal peptide synthetase，NRPS） 生物合成裝配路徑（biosynthetic assembly line）產(chǎn)生，鮑曼鐵蛋白A/B首次報道于2015年[7]，由枸櫞酸、1，3-二氨基丙烷、2，4-二氨基丁酸、癸烯酸和α-酮戊二酸組成，合成路徑為NRPs-非依賴性鐵載體合成酶（NIS）生物合成路徑（NRPS-independent siderophore synthetase biosynthetic process），三種載體一般不共存于一種菌株上，很多鮑曼不動桿菌菌株缺乏絲膜蛋白。

前不動桿菌素通過非酶促反應(yīng)異構(gòu)化生成不動桿菌素，pH＜6時，以前不動桿菌素形式存在，pH＞7時，異構(gòu)化生成不動桿菌素。Shapiro等[8]通過對晶體結(jié)構(gòu)模型的研究發(fā)現(xiàn)不動桿菌素可以以2∶1的比例與鐵離子結(jié)合，生成[Fe ( Acb )2]-1復(fù)合物，前不動桿菌素也可以與鐵離子以2∶1結(jié)合，生成 [Fe ( PreAcb )2]，絲膜蛋白和鮑曼鐵蛋白則以1∶1比例與鐵離子結(jié)合[8-10]。BauA、BauB是將鐵離子載體復(fù)合物轉(zhuǎn)運進入細菌體內(nèi)的重要蛋白質(zhì)類物質(zhì)，BauA具有典型的外膜TonB依賴性轉(zhuǎn)運蛋白折疊，其中β-barrel由22條反平行鏈，數(shù)個胞外環(huán)和折疊在桶內(nèi)的塞結(jié)構(gòu)域（plug domain）形成[11]；BauB結(jié)構(gòu)是典型的A類底物結(jié)合折疊，中心α-螺旋跨越較小的N-和C-末端結(jié)構(gòu)域，疏水性殘基介導(dǎo)配體結(jié)合在兩個結(jié)構(gòu)域之間的中央口袋中[9]。鐵離子載體復(fù)合物通過BauA轉(zhuǎn)運進入周質(zhì)中，再通過鐵載體結(jié)合蛋白BauB，前不動桿菌 素 /不動桿菌素載體復(fù)合物形成后被BauA特異性識別繼而呈遞給BauB，BauB再將載體復(fù)合物呈遞給ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（BauCDE），在ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)幫助下通過內(nèi)膜，最后在BauF的幫助下釋放鐵離子，在這個過程中，能量由TonB-ExbB-ExbD系統(tǒng)提 供。

在酸性條件下載體以前不動桿菌素形式存在，已被證實在中性至堿性條件下前不動桿菌素可轉(zhuǎn)化為不動桿菌素，但是在進入過程仍然存在一些爭議，有研究認(rèn)為2個分子不動桿菌素/前不動桿菌素都可以與Fe3+形成載體復(fù)合物，經(jīng)過相同通路進入菌體內(nèi)[8]，但也有研究通過對BauA功能結(jié)構(gòu)域的分析，發(fā)現(xiàn)BauA特異性識別的是前不動桿菌素，并且在堿性條件下，由1個分子不動桿菌素和1個分子前不動桿菌素共同與Fe3+結(jié)合形成載體復(fù)合物[11]，有研究表明在鐵限制條件下，絲膜蛋白鐵載體復(fù)合物和不動桿菌素鐵載體復(fù)合物均能促進細菌生長，在BauB上也發(fā)現(xiàn)了相對應(yīng)的功能結(jié)構(gòu)域，但是二者同時存在時卻會競爭結(jié)合周質(zhì)蛋白BauB，抑制細菌生長，而且不動桿菌素通常都存在于鮑曼不動桿菌體內(nèi)。因此，利用絲膜蛋白的結(jié)構(gòu)特點設(shè)計出靶點藥物，為對抗鮑曼不動桿菌提供了一種新思路[10]。

針對不動桿菌素，在其他細菌的研究上證實不動桿菌素和前不動桿菌素都是通過相同的途徑進入菌體內(nèi)，并且在鮑曼不動桿菌的BauB上也有分別的功能結(jié)構(gòu)域與之相結(jié)合作用，但是是否都是通過BauA進入，是否存在其他載體蛋白，或結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化等，未來需要更多相關(guān)研究。

2 Feo系統(tǒng)

在氧氣充足、pH值中性的情況下，F(xiàn)e3+是鐵的主要存在形式，但是在低氧酸性條件下主要以Fe2+的形式存在，比如人的胃腸黏膜等部位。Feo系統(tǒng)是另一鐵轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，負責(zé)在低氧偏酸條件下鮑曼不動桿菌對Fe2+的吸收，后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)福氏志賀菌、幽門螺桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌亦可以Fe2+吸收為主要獲取方式[12-13]。

Feo系統(tǒng)包含三個部分，分別是FeoA、FeoB、FeoC。FeoA是一種小的β桶蛋白，對于鮑曼不動桿菌的生長、黏附、生物膜的形成不可或缺，在小鼠肺炎模型中發(fā)現(xiàn)，敲除feoA基因會減弱細菌的生長、定植、感染等能力，對氧化應(yīng)激更加敏感，降低整體毒力作用[14]；FeoB是具有可水解GTP的可溶性G蛋白結(jié)構(gòu)域的多組分膜蛋白[15]，是Fe2+主動轉(zhuǎn)運的通道，研究顯示在福氏志賀菌、幽門螺桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌等菌株中出現(xiàn)FeoB基因突變，會造成Fe2+攝取障礙，毒力降低[13，16]，Subashchandrabose等[17]研究發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比較，在FeoB突變菌株中，抗菌肽對人血清補體和多黏菌素B的敏感性增加；FeoC是一種小的胞質(zhì)蛋白，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控子調(diào)控表達[18]。

迄今，F(xiàn)e2+在鮑曼不動桿菌中的利用機制仍然存在很多疑問，比如FeoB是如何水解GTP，F(xiàn)eo系統(tǒng)這三個部分如何協(xié)作運轉(zhuǎn)，F(xiàn)eoA、FeoB、FeoC三者之間的關(guān)系仍舊不清楚，僅在霍亂弧菌實驗中發(fā)現(xiàn)了FeoB和FeoC之間可能存在相互作用[19]。

3 其他

除了上述的模式，還有一種就是細菌通過直接獲取宿主體內(nèi)含血紅素的蛋白來間接獲取鐵[20]，是一種主動轉(zhuǎn)運的過程，同樣依賴于TonBExbB-ExbD的能量轉(zhuǎn)換供給。菌體先利用分泌出的血團結(jié)合含血紅素蛋白，再與外膜表面受體結(jié)合，在ABC系統(tǒng)幫助下穿過內(nèi)膜，進入菌體釋放出鐵離子。在這一途徑中表達數(shù)種血紅素相關(guān)的酶，其中血紅素加氧酶基因（heme oxygenase gene，hemo）研究較多。在19種暴發(fā)流行的鮑曼不動桿菌中都發(fā)現(xiàn)了含有hemo基因的基因簇[21]。對血紅素的利用增強菌株毒力作用。有研究表明高毒力暴發(fā)性鮑曼不動桿菌菌株LAC感染小鼠后，對血紅素的攝取和利用主要取決于hemo基因簇的表達，缺乏hemo基因簇的ATCC 17987菌株則不能利用血紅素[22]。

4 應(yīng)用

2017年，世界衛(wèi)生組織將鮑曼不動桿菌列為嚴(yán)重危害人類健康的一級細菌，呼吁大家共同解決相關(guān)問題。臨床上嘗試應(yīng)用多種抗生素，仍未取得顯著效果。鐵離子作為鮑曼不動桿菌生存所必須的物質(zhì)，引起人們極大關(guān)注。目前科研工作者們已經(jīng)開始探索一些螯合劑，如去鐵胺、去鐵銅等對鮑曼不動桿菌的影響，它們的最低抑菌濃度為32 mmol/L和64 mmol/L[23]。鎵類化合物中硝酸鎵對鮑曼不動桿菌ATCC 17978具有抑制作用，但是對LAC-4型鮑曼不動桿菌沒有任何作用，在一項肺炎小鼠模型中顯示鎵原卟啉Ⅸ（GaPPⅨ）能完全阻斷LAC-4型鮑曼不動桿菌中的Hemo途徑，菌株失去對硝酸鎵的耐受性和在血清中的生長優(yōu)勢，更重要的是，用GaPPⅨ處理經(jīng)鼻內(nèi)感染LAC-4的小鼠可防止肺外傳播和死亡[24]；還有研究表明抗生素和載體螯合劑的聯(lián)合應(yīng)用，比如達托霉素和鐵載體模擬物[25]除了鐵載體，在機制通路上任何一個環(huán)節(jié)都有可能成為抗菌藥物研發(fā)的突破口，TonB-ExbB-ExbD在鐵載體和血紅素攝取上都起到能量轉(zhuǎn)換供給的作用，其中對于TonB的了解甚少。研究發(fā)現(xiàn)，TonB1、TonB2對Fe3+的攝取作用不大，但是TonB3的存在是Fe3+攝取所需的必備條件，并且在小鼠和昆蟲感染模型中發(fā)現(xiàn)與鮑曼不動桿菌的毒力作用以及致病性密切相關(guān)，因此或可通過TonB3研發(fā)出相關(guān)減毒疫苗[25-26]，還有研究顯示利用BauA的功能結(jié)構(gòu)域，或可研發(fā)出相關(guān)免疫原候選[27]。

鮑曼不動桿菌耐藥問題亟待解決，目前缺乏根治性方案，金屬離子中比如鐵離子作為鮑曼不動桿菌生長發(fā)育過程中不可或缺的部分，引起人們關(guān)注。鐵離子參與細菌內(nèi)眾多的生化反應(yīng)，并與生物膜的形成、外排泵的調(diào)控等都有不可或缺的關(guān)系，是造成細菌毒力以及致病性的重要因素之一，在低鐵條件下，鐵調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達增強[4，28]；在鮑曼不動桿菌菌血癥基因表達分析中，557個蛋白質(zhì)編碼基因表達下調(diào)，329個上調(diào)，其中上調(diào)最明顯的就是鐵載體基因簇[29]。通過RNA測序分析了來自8例患者的多重耐藥菌株的縱向集，以鑒定差異表達的基因，并將其與導(dǎo)致患者和人群內(nèi)轉(zhuǎn)錄變異的遺傳變化聯(lián)系起來，經(jīng)過分析，發(fā)現(xiàn)宿主感染期間菌株會發(fā)生遺傳變異，新突變株通常富含編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子鐵的基因采集系統(tǒng)以及與表面相關(guān)的結(jié)構(gòu)[30]。有研究表明，在臨床ICU收集到的65株多重耐藥鮑曼不動桿菌，低鐵（＜20 μmol/L）條件下，外排泵aAdeABC的表達會增加四倍以上[31]，?；呓z氨酸內(nèi)酯和生物膜形成也會增加[32]。鐵離子的攫取依靠載體等進行，如果可以在任何一個環(huán)節(jié)造成細菌鐵離子的攫取障礙，就能一定程度上攻破鮑曼不動桿菌這一難題。目前對于鐵離子攫取機制的研究仍然有限，尤其對鮑曼鐵蛋白、絲膜蛋白、血紅素攝取、Feo系統(tǒng)都不夠了解，由于鐵攝取系統(tǒng)的多樣性，不同生理條件下狀態(tài)的不同，均提示單獨研究其中一點的效果不會很理想，未來需要更加全面、詳細的研 究。