李東倫 蘇 松 甘元濤 趙少勇 鄭英俊 淦 宇 方 程 李 波

(1 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科，四川省瀘州市 646000，電子郵箱：123509627@qq.com；2 四川省樂山市人民醫(yī)院肝膽外科，樂山市 614000；3 四川省宜賓市第二人民醫(yī)院肝膽外科，宜賓市 644000)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是臨床常見的急危重癥，若未得到及時有效的治療，最終可能導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)[1]。目前，大多數(shù)學(xué)者認為，腸道黏膜屏障損傷所致腸道通透性升高引起菌移位是SAP并發(fā)胰周感染的主要機制[2]。有關(guān)SAP發(fā)生時腸道菌群改變引起腸道黏膜損傷的研究較多[3]，但腸道黏膜損傷相關(guān)特異性表達蛋白的研究報告較少。本研究通過建立SAP大鼠模型，然后給予益生菌治療，再用同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技術(shù)[4]來篩選相關(guān)差異蛋白，以探討SAP發(fā)生時腸黏膜屏障損傷的機制，從而為SAP治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 戊巴比妥鈉(上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)試劑廠)，?；悄懰徕c(美國Sigma公司)，雙歧桿菌四聯(lián)活菌片(杭州龍達新科生物制藥有限公司)，血清淀粉酶測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，iTRAQ 8-plex標記試劑盒(美國AB SCIEX公司)。高速冷凍離心機(美國Sigma公司)，Bio-Rad電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)TripleTOFTM5600(美國AB SCIEX公司)，全波長酶標儀(瑞士Tecan公司)。

1.2 實驗動物 SD大鼠24只，8周齡，體重為250～300 g，實驗動物及專用飼料均由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[許可證號SYXK(川)2013-181]，大鼠分籠喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。

1.3 建模及干預(yù)方法 (1)分組：將大鼠按隨機數(shù)字表法分成SO組、ANP組和PRO組，每組8只。(2)建模及干預(yù)方法：ANP組及PRO組大鼠在造模前禁食12 h，可自由飲水，每只SD大鼠予以3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)腹腔注射麻醉，待麻醉成功后，將大鼠仰臥位固定于手術(shù)操作臺上。行大鼠上腹部正中切口，入腹后先找到胰膽管，然后在十二指腸外側(cè)壁用5號針頭逆行插入膽胰管，勻速注射3%牛磺膽酸鈉(用滅菌生理鹽水稀釋)。逐漸可見胰膽管周圍腫脹，局部胰腺顏色慢慢變黑、水腫伴充血，可初步判斷SAP大鼠模型造模成功，仔細縫合傷口，關(guān)腹[5]，術(shù)后繼續(xù)禁食，但不禁水。PRO組建模成功后，立即予以低溫(4℃)保存的益生菌制劑溶液[雙歧桿菌四聯(lián)活菌片(5 g)搗碎研磨成粉，加入無菌生理鹽水中，溶解后定容至50 mL，配制成10%的濃度]灌胃，劑量為1 mL/100 g,2次/d[6]。SO組為假手術(shù)組，行SD大鼠上腹部正中切口，開腹找到胰腺，翻動數(shù)次后，仔細縫合傷口，關(guān)腹，術(shù)后繼續(xù)禁食，但不禁水。

1.4 觀察指標 (1)血清淀粉酶：于造模后24 h、48 h各組分別取8只大鼠，每次經(jīng)心臟采血2 mL，室溫血液自然凝固10～20 min，2 000～3 000/min離心20 min，收集上清液，使用淀粉酶測定試劑盒檢測血清淀粉酶水平。(2)胰腺組織病理學(xué)：造模后48 h各組取8只大鼠，腹腔麻醉后取胰腺組織，制作組織切片后行蘇木精-伊紅 (hematoxylin-eosin，HE)染色，再根據(jù)Schimidt評分標準[7](見表1)進行胰腺組織病理評分。(3)小腸黏膜組織病理學(xué)：取好胰腺組織后，在距回盲部10 cm處取約5 cm的腸段，分成兩塊，一塊放入-80℃冰箱超低溫保存用于蛋白提取，另一塊經(jīng)HE染色后，參照Chiu氏評分表[8](見表2)評估小腸黏膜的損傷程度。(4)差異蛋白的篩選：取回腸組織標本加入裂解液(含7M尿素，2M硫脲，0.1%種蛋白酶抑制劑，65mM二硫蘇糖醇)，1 200 r/min離心15 min、酶解，最后加入iTRAQ試劑，1 200 r/min離心20 min干燥冷凍待用。采用高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)-TripleTOFTM5600進行蛋白質(zhì)分析，采用ProteinPilot軟件進行檢索，采用NCBI nr數(shù)據(jù)庫進行鑒定，選出明顯差異表達的蛋白(置信度在95%以上)。

表1 Schimidt評分表

表2 Chiu氏評分表

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗或方差分析；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。分別采用P<0.05且差異倍數(shù)(fold change,FC)>1.5篩選差異蛋白。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清淀粉酶水平比較 造模后24 h、48 h 3組大鼠血清淀粉酶水平比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，SO組、PRO組、ANP組血清淀粉酶均依次升高(均P<0.05)。見表3。

表3 3組大鼠血淀粉酶水平比較(x±s,U/L)

2.2 3組大鼠胰腺病理組織學(xué)表現(xiàn)及病理評分比較 肉眼觀SO組胰腺組織基本正常，ANP組與PRO組胰腺組織有不同程度的出血、水腫、散在小片狀皂化斑，見圖1。ANP組和PRO組胰腺病理評分高于SO組(均P<0.05)，見表4。

圖1 3組胰腺組織病理學(xué)改變(HE染色)

表4 3組大鼠胰腺和回腸組織病理評分比較(x±s，分)

2.3 3組大鼠回腸病理組織學(xué)表現(xiàn)及病理評分比較 HE染色結(jié)果顯示，ANP組回腸組織出現(xiàn)腸黏膜和絨毛輕度破損，與固有層無分離，固有層輕度瘀血，細胞成分較多；PRO組回腸組織腸黏膜和絨毛無破損，與固有層無分離，固有層輕度瘀血；SO組回腸組織腸黏膜和絨毛無破損，與固有層無分離，固有層無瘀血。見圖2。ANP組回腸組織病理評分高于SO組、PRO組(均P<0.05)，見表4。

圖2 3組回腸組織病理學(xué)改變(HE染色)

2.4 差異蛋白的篩選結(jié)果 ANP組和SO組共篩選和鑒定出49個差異表達的蛋白，與SO組比較，ANP組有12種蛋白表達上調(diào)，37種蛋白表達降低。PRO組和SO組共篩選和鑒定出107個差異表達的蛋白，與SO組比較，PRO組有6種蛋白表達上調(diào)，101種蛋白表達降低。兩組差異蛋白均包含雙皮質(zhì)醇樣激酶1(double cortin-like kinase 1,Dclk1)、半乳糖凝集素-1(galectin-1,Gal1)、轉(zhuǎn)膠蛋白、鈣調(diào)理蛋白-1(calponin 1,Cnn1)、ⅣC型磷脂酶A2(phospholipase A2 group ⅣC,Pla2g4c)、伴侶蛋白10、免疫球蛋白M重鏈(immunoglobulin heavy constant Mu,Ighm)、聯(lián)絲蛋白(synemin,Synm)、腸凝集素1(intelectin 1,Itln1)、胞漿型磷脂酶A2γ(cytosolic phospholipase A2 gamma,cPLA2γ)、活化b細胞RT1Blα鏈。

2.5 差異表達蛋白的生物信息學(xué)分析

2.5.1 差異表達蛋白基因本體分析：(1)ANP組和SO組49個差異表達的蛋白中有51%的差異蛋白參與生物過程，16%參與分子功能，33%為細胞成分的組成部分。這些差異表達蛋白涉及的生物學(xué)過程有信號傳導(dǎo)、代謝、免疫應(yīng)答、細胞運動、蛋白結(jié)合、載體活性、結(jié)構(gòu)分子活性、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、催化活性、調(diào)控因子等，其主要參與組織代謝等生物過程，涉及蛋白結(jié)合、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性等分子功能，主要定位于細胞膜、細胞器、大分子復(fù)合物等細胞成分。(2)PRO組與SO組107個差異蛋白中有47%的差異蛋白參與生物過程，21%涉及分子功能，32%為細胞成分的組成部分。差異表達蛋白涉及的功能有信號傳導(dǎo)、代謝、免疫應(yīng)答、細胞運動、蛋白結(jié)合、電子載體活性、抗氧化劑活性、轉(zhuǎn)運體活性、結(jié)構(gòu)分子活性、分子傳導(dǎo)活性、調(diào)控因子等，其中主要參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答等生物過程，涉及調(diào)控因子等分子功能，主要定位于細胞膜、突觸結(jié)構(gòu)等細胞成分。

2.5.2 差異表達蛋白的通路分析：(1)ANP組和SO組中49個差異表達蛋白主要涉及磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信號通路、寄生蟲侵襲及炎癥相關(guān)的通路、代謝相關(guān)的信號通路等。(2)PRO組與SO組中107個差異表達蛋白主要涉及磷酸鳥苷-蛋白激酶G信號通路、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、內(nèi)/外分泌系統(tǒng)相關(guān)過程及代謝相關(guān)的信號通路等。

2.5.3 差異表達蛋白的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)：(1)圖3為ANP組與SO組差異表達蛋白的蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)圖，圖中每個球體表示一種蛋白質(zhì)，中間區(qū)域核心節(jié)點處的蛋白研究價值最大，分別為Dclk1、活化b細胞RT1B1α鏈(activated B cell RT1B1 alpha chain,RT1-Ba)、Cnn1、Ⅰ型膠原α1鏈(collagen type Ⅰ alpha 1 chain,Col1a1)、熱休克蛋白B族(小)成員1[heat shock protein family B(small)member 1,Hspb1]等。(2)圖4為PRO組與SO組差異表達蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，位于核心節(jié)點處的蛋白有熱休克蛋白A族(小)成員5[heat shock protein family A(small)member 5,Hspa5]、脯氨酸4-羥化酶β亞基(prolyl 4-hydroxylase subunit beta,P4hb)、FKBP脯氨酸異構(gòu)酶1A(FKBP prolyl isomerase 1A,Fkbp1a)、磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase 1,Pgk1)、蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase,Mdh)1、Mdh2、蛋白酶體20s亞基β2(proteasome 20S subunit beta 2,Psmb2)等。(3)最終在ANP組與SO組、PRO組與SO組的差異蛋白中篩選出關(guān)聯(lián)性最強的蛋白質(zhì)有膠轉(zhuǎn)蛋白、Gal1。

圖3 ANP組與SO組差異表達蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 PRO組與SO組差異表達蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

大多數(shù)研究者認為，SAP后的菌移位引起腸道黏膜屏障損傷而所致的腸道通透性升高，是SAP并發(fā)胰周感染的主要機制[2]。而益生菌應(yīng)用于SAP并發(fā)胰周感染的療效也得到了臨床的肯定[9]。近年來隨著生物信息學(xué)的高速發(fā)展，生物醫(yī)學(xué)的研究跨入了基因時代，在疾病發(fā)生和發(fā)展的過程中，蛋白質(zhì)作為承載基因的載體扮演著極其重要的角色，因此針對蛋白質(zhì)的研究熱度與深度也日益提高[4]。蛋白質(zhì)組學(xué)為大多數(shù)疾病的發(fā)生和發(fā)展機制研究提供了新的思路[9]。研究發(fā)生SAP時腸黏膜屏障損傷的差異表達蛋白，對治療SAP并發(fā)胰周感染有重要意義。

我們的前期實驗結(jié)果顯示，益生菌能夠減輕SAP發(fā)生時腸黏膜的損傷程度，提示益生菌對SAP后的腸黏膜具有保護作用。此外有研究顯示，益生菌減輕腸黏膜炎癥的作用與某些差異表達蛋白有關(guān)，具體機制可能與差異蛋白重組蛋白質(zhì)導(dǎo)致細菌移位或者調(diào)控免疫功能從而減少炎癥反應(yīng)有關(guān)[10]。為進一步探索SAP發(fā)生時腸黏膜屏障損傷的機制，我們建立SAP大鼠模型，并給予益生菌干預(yù)，結(jié)果顯示，與ANP組比較，PRO組大鼠的腸黏膜和絨毛損傷程度減輕，血淀粉酶水平以及回腸的病理評分降低，提示益生菌不僅有利于降低血清淀粉酶水平，且對腸黏膜具有保護作用。

我們進一步采用生物信息學(xué)分析篩選出差異表達的蛋白，結(jié)果顯示，與SAP發(fā)生時腸黏膜屏障損傷有關(guān)的差異表達蛋白可能有Gal1、轉(zhuǎn)膠蛋白、Cnn1、Pla2g4c、伴侶蛋白10、Ighm、Synm、Itln1，其中轉(zhuǎn)膠蛋白、Gal1關(guān)聯(lián)性最強。分析其可能的參與機制為：(1)轉(zhuǎn)膠蛋白是肌動結(jié)合蛋白鈣調(diào)蛋白家族中的成員之一[11]，其可抑制間質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)的表達進而抑制炎癥發(fā)展[12]，而MMP9是一種參與機體重組過程的酶，重組后可導(dǎo)致癌細胞的運動、細菌的移位。(2)Gal1是半乳糖凝集素家族的成員之一，其可以通過調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答來影響炎癥及免疫功能[13]。Gal1通過促進CD8+T淋巴細胞、輔助T細胞1和輔助T細胞17的凋亡，抑制促炎因子白細胞介素2和γ-干擾素的分泌來減輕炎癥反應(yīng)，同時還分泌抗炎因子白細胞介素10和轉(zhuǎn)化生長因子來抑制炎癥反應(yīng)[14-16]。但是該蛋白具體通路以及在腸黏膜損傷中的具體機制仍需進一步研究探索。

綜上所述，益生菌對SAP大鼠的腸黏膜損傷具有一定的改善作用，其可能通過調(diào)節(jié)差異表達蛋白的表達減輕SAP所致的腸黏膜損傷，但相關(guān)蛋白具體通路機制并不是很明確，仍需進一步探索與研究。