劉雯，米瑞華，胡杰英

(鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院/河南省腫瘤醫(yī)院 a.中心實驗室；b.血液科，河南 鄭州 450008)

急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是一種常見的惡性血液病，以骨髓和淋巴組織中不成熟淋巴細胞的異常增殖和聚集為特點，生物學特征多樣，臨床異質性很大[1]。ALL的特異性染色體重排與白血病細胞的免疫學亞型相關。染色體易位t(4；11)(q21；q23)見于2%～6%的ALL，免疫學分型方法顯示前或早前急性B淋巴細胞白血病表型，分子學檢測揭示該易位導致原來位于4號染色體長臂2區(qū)1帶(q21)的AF4基因和位于11號染色體長臂2區(qū)3帶(q23)的混合譜系白血病基因(mixed lineage leukemia，MLL)并置在一起，形成了MLL-AF4融合基因[2]。在MLL-AF4融合基因顯示陽性的ALL患者中，50%是不滿6個月的嬰兒，稍大一點的嬰兒占10%～20%，成人占7%[2]。嬰幼兒中完全緩解率(complete remission，CR)為88%，但中位總體生存時間(median overall survival，OS)僅為10個月。在成人患者中，CR為88%，但OS也僅為7個月[2]。多數患者在臨床治療中會對現有常規(guī)化療耐藥，進行造血干細胞移植、生物治療、聯合抗反轉錄病毒治療(combined antiretroviral therapy，cART)后也容易復發(fā)，是一個獨立的預后不良因素，其發(fā)病機制不明，暫缺乏有效的靶向治療措施。本研究對6例成人t(4；11)(q21；q23)急性淋巴細胞白血病應用RT-RCR檢測融合基因，并通過熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization，FISH)檢測加以驗證，對臨床和實驗室特點亦進行了總結，以提高對成年伴t(4；11)(q21；q23)急性淋巴細胞白血病的認識。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集2014年4月至2020年4月鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院/河南省腫瘤醫(yī)院染色體檢測標本共9 662例，其中初診ALL 323例，占3.34%。伴t(4；11)(q21；q23)急性淋巴細胞白血病7例，占ALL的2.17%，女4例，男3例，1例為兒童，6例為成人，成人中位發(fā)病年齡40歲。6例患者均接受血常規(guī)、細胞形態(tài)學、細胞遺傳學、MLL-AF4融合基因檢測、免疫分型檢測、FISH檢測。

1.2 染色體核型分析方法染色體標本采用R顯帶法分析，取患者骨髓標本，每份標本分別用小牛血清和1640培養(yǎng)液常規(guī)短期培養(yǎng)，秋水仙堿阻滯細胞停留在細胞分裂中期，使用氯化鉀低滲，經甲醇/冰乙酸固定液(甲醇和乙酸體積比為3∶1)固定后制片，Earle’s顯帶液顯帶，Giemsa染色液染色。運用德國ZISS公司生產的染色體全自動掃描分析系統(tǒng)掃描采集中期細胞圖像，核型異常識別和描述參照《人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN2016)》。

1.3 MLL-AF4檢測方法對MLL-AF4基因采用實時反轉錄聚合酶鏈反應(real-time reverse transcription，RT-PCR)檢測，抽取患者外周血2 mL，提取總RNA，以ABL基因為內參基因。

1.4 免疫分型應用流式細胞儀間接免疫熒光法和一組單抗檢測腫瘤細胞的表面抗原。判斷標準為胞質抗原≥10%為陽性，細胞膜表面抗原≥20%為陽性。

1.5 FISH檢測MLL基因重排檢測探針購自美國雅培公司，-20 ℃保存?zhèn)溆谩LL雙色斷裂重排探針是用于檢測11號染色體2區(qū)3帶MLL基因的易位與重排。標本用探針標記后在Olympus BX51熒光顯微鏡的DAPI/FITC/TRITC三色濾光鏡下觀察細胞熒光雜交信號：兩黃色熒光信號者為MLL斷裂重排陰性細胞，一紅一綠一黃色熒光信號者為MLL基因斷裂重排陽性細胞，每例至少分析200個間期細胞。計算陽性細胞的比率。應用VideoTest FISH 2.1圖像分析系統(tǒng)進行圖像采集并保存。

2 結果

2.1 臨床和血液學特點初診時外周血中位白細胞計數為268(2.16～638)×109L-1，中位血小板計數為85(15～148)×109L-1，中位血紅蛋白53.5(36～76)g·L-1，中位骨髓原始、幼稚淋巴細胞百分比66.8%(37.5%～91%)，中位總體生存期10(6～41)個月。

2.2 染色體核型分析6例患者的染色體核型結果見表1。例1、2、3、6核型為單純t(4；11)(q21；q23)(圖1)，例4同時合并衍生4號染色體(der4)，例5合并衍生10號染色體異常(der10)。

表1 6例伴t(4；11)急淋患者細胞遺傳學、分子生物學及治療反應

圖1 核型異常的骨髓樣本的細胞遺傳學分析(箭頭示易位染色體)

2.3 RT-PCR對6例患者進行RT-PCR檢測，均為MLL-AF4融合基因陽性。

2.4 流式免疫分型以異常幼稚B淋巴細胞為主，例1表達CD19、CD22、CD123、HLA-DR、cCD9a、CTDT，弱表達CD38、CD15。例2表達CD45、CD19、CD38、CD123、CD10-、CD34-、CD20-。例3表達CD38、HLR-DR、CD19、CD15、CD22、cCD79。例4表達CD19、CD38、CD58，部分表達CD22、CD123、cCD79a。例5表達CD19、CD38、HLA-DR、cCD22、cTDT、cCD79a，部分表達CD2，弱表達CD15。例6異常淋系表型，表達CD19、CD38、CD81、CD200、CD43、cCD79a，少部分表達CD10。

2.5 FISH檢測6例患者均經FISH檢測證實為MLL基因分離重排陽性。

3 討論

本研究中6例成人t(4；11)(q21；q23)染色體易位的患者臨床診斷均為急性淋巴細胞白血病，研究表明該易位產生MLL-AF4融合基因。MLL-AF4融合基因又稱為組蛋白賴氨酸[K]-甲基轉移酶2A基因(KMT2A-AFF1基因)，KMT2A-AFF1融合蛋白參與造血干細胞的自我更新分化，高表達引起不良預后[3]。t(4；11)(q21；q23)染色體易位與急性淋巴細胞白血病高度相關，歐洲1lq23協作組曾報道過183例伴t(4；11)的急性白血病，在這些病例中絕大部分(94.5%)為ALL，證實了t(4；11)和ALL高度相關[4]。

t(4；11)(q21；q23)染色體易位的ALL臨床表現常伴肝脾大、淋巴結浸潤；本組患者染色體核型分析有附加異常2例，無附加異常單純4例，11易位的4例，免疫表型以異常B淋巴細胞為主，6例患者均表現為MLL基因重排，這種重排會導致極差的急性淋巴細胞白血病預后，疾病惡性程度很高，5例死亡，1例發(fā)病8個月，目前仍在治療中。雖然這種類型白血病中成人占比較低，但如何提高這類疾病的預后仍是需要去探索的問題。由于患者對化療的不敏感以及腫瘤較高的惡性程度，除了針對性解決外周血白細胞升高、血小板降低、貧血等臨床癥狀，預防中樞神經系統(tǒng)白血病的發(fā)生，異基因造血干細胞移植也是這類患者獲得長期無病生存、重建免疫功能及造血功能的重要治療策略。但一些患者由于疾病進展太快，無法找到適合移植的供者，同時也面臨著移植費用較高及移植后存在排異反應風險的難題。

對比6例患者的免疫表型發(fā)現，均表達CD19特異性蛋白，其中有1例患者接受了嵌合抗原受體基因修飾靶向B細胞惡性腫瘤抗原CD19(CART-19)的免疫細胞治療臨床試驗，但并沒有取得很好的療效，原因可能在于復發(fā)后疾病進展比較迅速，如果在疾病早期盡早干預可能會取得更好的效果，對于效果的驗證需要更多的臨床數據來支撐。國內很多實驗室都成功建立了CART-19細胞的體外擴增體系，體外殺傷實驗確定CART-19細胞能特異殺傷CD19陽性的腫瘤細胞[5]。但只有在解決了安全性、有效性等問題后，才能廣泛應用于臨床治療。

最新的一項研究是MLL-AF4通過激活關鍵靶基因促進白血病的發(fā)生，一個關鍵的MLL-AF4靶基因是PROM1，它編碼了CD133[6]；CD133是一種5次跨膜糖蛋白，它代表了一種潛在的泛癌靶點，存在于多種癌癥干細胞中；異常的PROM1/CD133表達對于白血病細胞生長是必需的，由MLL-AF4基因的直接結合介導；上述結果提供了第1個詳細的分析方案，解釋了CD133在巨噬細胞白血病細胞中的表達。PROM1/CD133作為潛在治療靶標最吸引人的特征之一來自于對該基因是MLL-AF4調節(jié)的直接靶標的認識[7]，這表明在t(4；11)白血病中PROM1/CD133的表達與融合蛋白本身的活性緊密相關。了解這些機制可能是將來在這類白血病中開發(fā)PROM1/CD133導向的靶向治療的關鍵。