張林 謝穎 李鑫 陳洪雨

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）[1-2]是由骨髓中終末分化的漿細(xì)胞克隆擴(kuò)增所引起的血液惡性腫瘤，可導(dǎo)致體內(nèi)多器官發(fā)生損害，患者最終出現(xiàn)骨痛、骨質(zhì)破壞、腎功能不全、高鈣血癥以及造血功能抑制所致的貧血、易感染等一系列臨床表現(xiàn)。MM中醫(yī)屬“骨痹”、“虛勞”、“骨蝕”等范疇。大量臨床實(shí)驗(yàn)表明，雖然傳統(tǒng)方法如化療等明顯提高了治愈率，但仍存在不同程度的不良反應(yīng)、毒副反應(yīng)、耐藥性及易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)[3-7]。

抗骨痹方是紹興市人民醫(yī)院在祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中有關(guān)醫(yī)治“骨痹”、“骨蝕”等疾病過程中總結(jié)的自擬方，在臨床上療效明顯，該方與傳統(tǒng)的化療方案對(duì)比有一定的優(yōu)勢(shì)，組方中主要的4味中藥為白花蛇舌草、半枝蓮、山慈菇和蚤休。其中白花蛇舌草具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、增強(qiáng)免疫的作用；半枝蓮除清熱解毒和抗炎作用外，還被廣泛應(yīng)用于多種惡性腫瘤的治療；山慈菇具有清熱解毒，消癰散結(jié)等功效；蚤休可治癰腫、肺癆久咳、跌打損傷、蛇蟲咬傷、淋巴結(jié)核、骨髓炎等疾病，近年來發(fā)現(xiàn)其有抗癌功效。本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[8]的方法研究抗骨痹方中主要4味中藥在治療MM中的主要靶點(diǎn)和通路，以期為未來深入研究并驗(yàn)證其相關(guān)機(jī)制提供參考。

1 材料和方法

1.1 活性成分篩選和靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫及分析平臺(tái)（traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP）數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）對(duì)白花蛇舌草、半枝蓮、山慈菇、蚤休的化學(xué)成分進(jìn)行收集?；赥CMSP數(shù)據(jù)庫中的吸收、分布、代謝和排泄（absorption,distribution,metabolism and excretion,ADME）參數(shù)進(jìn)行篩選（篩選規(guī)則：口服生物利用度≥30%，類藥性≥0.18），篩選出活性成分。獲得大量的活性成分后將化學(xué)成分信息在線提交到中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具（bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional chinese medicine,BATMAN-TCM） 數(shù)據(jù)庫（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/），并選擇可信度較高的蛋白作為預(yù)測(cè)靶點(diǎn)（Score cutoff＞20）。將檢索得到的靶點(diǎn)使用Uniprot數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化為統(tǒng)一名稱。經(jīng)上述操作后獲得與活性成分相關(guān)的靶點(diǎn)信息。

1.2 MM相關(guān)基因收集 通過DisGeNET數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/）收集MM相關(guān)基因。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析 將4種單味藥的活性成分作用靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)做映射，得到兩者共同作用靶點(diǎn)。采用Cytoscape軟件構(gòu)建：（1）成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，如果某一蛋白是化合物作用的靶點(diǎn)，則它們之間進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)連接；（2）使用互作基因/蛋白質(zhì)檢索的搜索工具數(shù)據(jù)庫（search tool for the retrieval of interacting genes/proteins,STRING）（https://string-db.org/） 構(gòu)建靶點(diǎn)的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interactions,PPI）。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的分析 將PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析和聚類分析。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析運(yùn)用Cytoscape軟件中的工具Network Analyzer來計(jì)算自由度degree和介數(shù)（Edge Betweenness）這兩個(gè)重要的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，并設(shè)定拓?fù)鋮?shù)的閾值從PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出Hub基因。網(wǎng)絡(luò)聚類分析使用軟件Cytoscape的插件ClusterONE（ClusterONE算法可以主要解決的是蛋白質(zhì)復(fù)合物的類別識(shí)別問題，也就是PPI網(wǎng)絡(luò)中密集子結(jié)構(gòu)的識(shí)別問題。ClusterONE算法中，內(nèi)聚力得分越高則代表了該組蛋白質(zhì)越有可能是一種蛋白質(zhì)復(fù)合物）來處理。

1.5 通路富集分析 采用Cytoscape插件ClueGO對(duì)Hub基因進(jìn)行KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析（設(shè)定閾值 P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 抗骨痹方活性成分以及靶點(diǎn)信息的篩選結(jié)果 通過TCMSP和BATMAN數(shù)據(jù)庫獲得白花蛇舌草的活性成分有7個(gè)，半枝蓮29個(gè)，山慈菇3個(gè)，蚤休4個(gè)，見表1。

表1 抗骨痹方活性成分的信息

2.2 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖和PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將獲得的抗骨痹方主要成分的活性成分和映射得到的靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape，構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（圖1、2）。其中棱形節(jié)點(diǎn)代表中藥的活性成分，圓形節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)蛋白。其中不同顏色代表節(jié)點(diǎn)的自由度（Degree）不同，顏色從黃到紅，自由度依次增大。自由度越大，說明節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要程度越大?；钚猿煞?靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖反映了中藥成分與靶點(diǎn)蛋白關(guān)系的重要性。

將映射得到的靶點(diǎn)蛋白在線輸入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建白花蛇舌草、半枝蓮、山慈菇、蚤休的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）（圖3），不同顏色的圓形節(jié)點(diǎn)代表著不同的靶點(diǎn)蛋白，連線表示蛋白與蛋白之間的相互聯(lián)系。

圖1 4味中藥的單獨(dú)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（a：白花蛇舌草；b：半枝蓮；c：山慈菇；d：蚤休）

圖2 4味中藥的總成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.3 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浜途垲惙治?采用Cytoscape中的Network analysis工具對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，提交到BATAMN數(shù)據(jù)庫后獲得可信度較高（Score cutoff＞20）的蛋白靶點(diǎn)信息，并與疾病靶點(diǎn)映射后得到映射靶點(diǎn)，篩選出Hub基因（自由度＞均值）共12個(gè)，見表2。其中自由度最高的是AKT1和PIK3CG，自由度均為19，表示這兩者均能與19個(gè)蛋白產(chǎn)生相互作用，在整個(gè)蛋白網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵作用。

表2 Hub基因信息

此外采用了ClusterONE算法對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果顯示size≥3的模塊有6類，模塊參數(shù)見表3。

表3 映射靶點(diǎn)的聚類分析

采用Cytoscape插件ClueGO，對(duì)篩選出的Hub基因進(jìn)行KEGG通路富集（圖4、5，插頁）分析。結(jié)果以基因和通路相聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)圖以及柱狀圖呈現(xiàn)4味藥治療MM的作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)圖中，顏色相同的節(jié)點(diǎn)表示Kappa Score值相同，帶有紅色標(biāo)簽的節(jié)點(diǎn)為基因，連線表示兩者之間有相互作用的關(guān)系；柱狀圖上的數(shù)字表示相關(guān)基因的個(gè)數(shù)，橫坐標(biāo)表示的是進(jìn)行分析的與每個(gè)term相關(guān)的基因個(gè)數(shù)占與每個(gè)term相關(guān)總基因個(gè)數(shù)的比例，柱狀圖的左邊為每個(gè)term的全稱，數(shù)字表示進(jìn)行分析的基因與term相關(guān)的個(gè)數(shù)。

圖4 KEGG通路富集分析網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 KEGG通路富集分析柱狀圖

3 討論

MM 屬中醫(yī)“骨痹”、“虛勞”、“骨蝕”等范疇。“骨痹”最早見于《素問·長刺節(jié)論篇》曰：“病在骨，骨重不可舉，骨髓酸痛，寒氣至，名曰骨痹”。骨痹由機(jī)體正氣不足，衛(wèi)外不固，外無御邪之能，內(nèi)乏抗病之力，復(fù)因久住濕地，汗出當(dāng)風(fēng)、冒雨、涉水，風(fēng)寒濕之邪內(nèi)侵于骨，遂成骨痹[9]。因此中醫(yī)以驅(qū)邪活絡(luò)、緩急止痛為原則來治療MM。

本研究發(fā)現(xiàn)抗骨痹方的主要4味藥的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)為AKT1、PIK3CG、PTGS2等。AKT1是3個(gè)緊密相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1、AKT2和AKT3）之一，它被稱為AKT激酶，參與調(diào)節(jié)許多生物學(xué)過程，包括代謝、增殖、細(xì)胞存活、生長和血管生成等[10]。已知AKT1是β-谷甾醇（白花蛇舌草和山慈菇）、豆甾醇（山慈菇）的作用靶點(diǎn)，而甾醇類化合物具有刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)增生，加強(qiáng)吞噬細(xì)胞吞噬癌細(xì)胞的能力[11]。譚寧華等[12]采用白花蛇舌草的乙醇提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行了細(xì)胞毒活性篩選，發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草提取物有一定的細(xì)胞毒性，并從中分離出了甾醇類化合物。Gabay等[13]研究發(fā)現(xiàn)，豆甾醇具有抑制炎癥和基質(zhì)降解的作用，可通過阻礙1L-1β誘導(dǎo)的NF-κB通路來發(fā)揮作用。PIK3CG（磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸-3-激酶）參與磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸（PIP3）的合成，PIP3在激活細(xì)胞生長、存活、增殖、運(yùn)動(dòng)和形態(tài)的信號(hào)級(jí)聯(lián)等方面起著關(guān)鍵的作用。本研究已篩選出PIK3CG是槲皮素（白花蛇舌草）的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。槲皮素的藥理研究中對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞均有抑制生長的作用，包括胃癌細(xì)胞[14-15]、肝癌細(xì)胞[16]、乳腺癌細(xì)胞[17]等。PTGS2又稱前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（COX2），負(fù)責(zé)合成重要的生物激素——前列腺素家族的介導(dǎo)物質(zhì)。PTGS2的上調(diào)與細(xì)胞黏附增加、表型改變有關(guān)。據(jù)近些年來的流行病學(xué)研究，PTGS2在多種腫瘤中普遍存在過度表達(dá)的現(xiàn)象。已知PTGS2為對(duì)羥基芐基酮（半枝蓮）及2-甲氧基-3-甲基蒽-9，10-酮（為白花蛇舌草蒽醌類成分）的作用靶點(diǎn)。目前，關(guān)于蒽醌類和芳香酮類化合物抗腫瘤的研究很少，有待進(jìn)一步的研究。研究者從KEGG通路富集結(jié)果中選出3個(gè)Term來進(jìn)行分析，包括細(xì)胞凋亡（Apoptosis）、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號(hào)通路（Neurotrophin signaling pathway）、慢性粒細(xì)胞白血?。–hronic myeloid leukemia）。從STRING數(shù)據(jù)庫的Analysis可得知，白花蛇舌草和山慈菇均存在與這3個(gè)Term相關(guān)的蛋白靶點(diǎn)，蚤休和半枝蓮雖對(duì)上述通路無調(diào)節(jié)作用，但可調(diào)節(jié)卵巢類固醇激素分泌、花生四烯酸代謝等其它生物過程。細(xì)胞凋亡作為可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的一種重要自穩(wěn)機(jī)制[18-20]，一直以來是人們的研究熱點(diǎn)。Jiang等[21]研究了白花蛇舌草對(duì)人骨髓增生異常綜合征細(xì)胞系的凋亡誘導(dǎo)作用，發(fā)現(xiàn)其可通過激活半胱天冬酶和抑制PI3K/AKT途徑來發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。神經(jīng)營養(yǎng)因子包括神經(jīng)生長因子家族、膠質(zhì)源性神經(jīng)生長因子以及其它神經(jīng)營養(yǎng)因子[22]。目前，關(guān)于腦源性神經(jīng)生長因子（BDNF）對(duì)MM疾病機(jī)制研究較多[23]。實(shí)驗(yàn)證明，BDNF、生長因子以及高親和力受體原肌球蛋白受體激酶B（TrkB）有助于MM細(xì)胞的生存[24]。血小板是BDNF等生長因子的重要儲(chǔ)存場(chǎng)所，已有研究證明血小板促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制可能與腫瘤細(xì)胞聚集體的形成和聚集體黏附到血管內(nèi)皮細(xì)胞有關(guān)[25]。郭一萌[26]觀察了槲皮素等對(duì)血小板聚集的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素對(duì)血小板的抑制作用最強(qiáng)，抑制率可達(dá)（68.33±2.43）%。慢性粒細(xì)胞白血病是一種由多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來，以骨髓粒細(xì)胞系統(tǒng)無限制性增生及部分分化為特征的白血病。已有研究證明，槲皮素能誘導(dǎo)人慢性髓系白血病細(xì)胞增殖抑制和凋亡，其機(jī)制可能是通過抑制JAK2/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的[27]，而JAK2/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路是MM細(xì)胞的重要通路，其活化受到抑制，可強(qiáng)烈誘導(dǎo)MM細(xì)胞的凋亡[28]。

本研究采用了多個(gè)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究分析平臺(tái)，研究了抗骨痹方主要4味中藥的活性成分和靶點(diǎn)，并構(gòu)建了成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)通過多種方法對(duì)關(guān)鍵的蛋白靶點(diǎn)和Hub基因相關(guān)通路進(jìn)行了分析，進(jìn)一步證實(shí)了抗骨痹方是通過AKT1、PIK3CG、PTGS2等多靶點(diǎn)及調(diào)控細(xì)胞凋亡和神經(jīng)營養(yǎng)因子信號(hào)通路等過程從而發(fā)揮多靶點(diǎn)、多通路的抗MM的作用。

本研究為進(jìn)一步了解抗骨痹方在治療MM中的作用機(jī)制和特點(diǎn)提供了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)證據(jù)，為臨床上中醫(yī)藥方法治療骨髓瘤提供了重要的參考依據(jù)，也為進(jìn)一步開發(fā)和深入研究該組方奠定了基礎(chǔ)。