何興楨 潘翔 鄭培奮

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是常見的惡性腫瘤之一，其預(yù)后較差，嚴(yán)重威脅我國(guó)人口的健康[1-2]。HCC早期癥狀不典型，起病隱匿，且具有高惡性程度、高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移率等特點(diǎn)，因此盡管目前對(duì)于HCC的治療方法逐漸增多，包括手術(shù)治療、介入治療、放化療及靶向治療等[3]，但HCC患者預(yù)后仍不理想。因此，如果能夠發(fā)現(xiàn)HCC早期診斷、治療以及預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物，將對(duì)臨床診療有重要的意義。

隨著大數(shù)據(jù)時(shí)代的到來(lái)，目前生物信息學(xué)在腫瘤中的應(yīng)用越來(lái)越廣，通過(guò)生物信息學(xué)分析尋找HCC中異常表達(dá)的基因，可為尋找HCC的生物標(biāo)志物提供依據(jù)。miRNA是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，由于miRNA在組織、血漿中可穩(wěn)定存在，并在腫瘤組織中存在異常表達(dá)，且可調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等細(xì)胞學(xué)進(jìn)程，是可選的生物標(biāo)志物之一[4-5]。miR-100-5p作為miRNA家族的一員，在膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等腫瘤中均存在異常表達(dá)，并和疾病分期及預(yù)后相關(guān)[6-7]。而在HCC中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-100-5p表達(dá)水平低于正常肝臟組織，與患者預(yù)后相關(guān)，且過(guò)表達(dá)miR-100-5p可抑制HCC進(jìn)展[8-9]。為進(jìn)一步明確miR-100-5p在HCC患者預(yù)后中的臨床意義，本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析及組織標(biāo)本表達(dá)檢測(cè)，評(píng)估m(xù)iR-100-5p用于不同臨床特征HCC患者預(yù)后監(jiān)測(cè)的臨床意義。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2004年1月至2013年12月于浙江醫(yī)院就診的HCC患者118例，其中男77例，女41例，年齡 21～79（50.29±14.00）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥18歲；（2）患者需經(jīng)病理確診為HCC（診斷依據(jù)為2010版AJCC癌癥分期手冊(cè)），有完整的臨床數(shù)據(jù)及隨訪信息；（3）患者不存在其他原發(fā)腫瘤相關(guān)疾病。末次隨訪時(shí)間為2018年12月，所有患者均知情同意，本研究經(jīng)浙江醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及SYBRGreen PCR kit試劑盒均購(gòu)自中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；miR-100-5p前引物購(gòu)自中國(guó)上海吉馬生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 獲取HCC石蠟組織塊，按說(shuō)明書方法使用Trizol提取標(biāo)本中總RNA，并測(cè)定提取得到的總RNA濃度，以1 μg總RNA為底物，在普通PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲取cDNA。反應(yīng)條件：37℃，60 min；95℃，5 min。以cDNA為模板，使用miScript SYBR-Green PCR kit試劑盒進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。RT-qPCR所用引物如下：miR-100-5p前引物：5′-ACACTCCAGCTGGGAACCCGTAGATCCGA-3′，后引物：通用引物。內(nèi)參U6前引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；后引物:5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)體系：模板cDNA1μl，miR-100-5p上游引物1 μl，10*miScript通用引物 2 μl，2*Quanti TectS YBR Green PCR Master Mix 10 μl，加無(wú)酶水至總反應(yīng)體積20 μl。反應(yīng)條件：95 ℃，15 min；94 ℃，15 s；55 ℃，30 s；70℃，30 s；共計(jì)40個(gè)循環(huán)。

1.4 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（www.cancergenome.nih.gov）中可獲取HCC患者預(yù)后數(shù)據(jù)，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)中患者預(yù)后信息和miR-100-5p表達(dá)水平繪制生存曲線，以miR-100-5p表達(dá)水平中位數(shù)為界，將患者分為miR-100-5p低表達(dá)組和高表達(dá)組。采用log-rank檢驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-100-5p和HCC患者預(yù)后的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；采用Kaplan-Meier分析和log-Rank檢驗(yàn)繪制生存曲線；采用單變量和多變量Cox回歸分析miR-100-5p和患者預(yù)后的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC組織miR-100-5p低表達(dá)、高表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 miR-100-5p低表達(dá)、高表達(dá)與臨床分期有關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而與年齡、性別、腫瘤長(zhǎng)徑無(wú)關(guān)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

2.2 HCC組織miR-100-5p表達(dá)和患者預(yù)后的關(guān)系對(duì)影響HCC預(yù)后的相關(guān)臨床因素進(jìn)行單因素和多因素分析，結(jié)果顯示腫瘤高分期和miR-100-5p低表達(dá)是HCC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P＜0.05），其HR值及95%CI分別為 0.269（0.138～0.523）、2.569（1.277～5.169），見表 2。

miR-100-5p低表達(dá)組預(yù)后生存率明顯低于高表達(dá)組患者（P＜0.01，圖1a），這和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的預(yù)測(cè)的結(jié)果相同（P＜0.01，圖1c）。且高分期（Ⅲ+Ⅳ期）HCC患者預(yù)后生存率低于低分期（Ⅰ+Ⅱ期）組（P＜0.01，圖1b）。并且在不同亞組中miR-100-5p表達(dá)水平與HCC預(yù)后關(guān)系各不相同，其中在高分期（圖2b）、低齡（≤60歲）（圖 2c）、男性（圖 2e）、小組織（腫瘤長(zhǎng)徑≤5 cm）組（圖2g）中，低表達(dá)miR-100-5p患者的生存時(shí)間更短差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而在低分期（圖2a）、高齡（＞60歲）（圖2d）、女性（圖 2f）、大組織（腫瘤長(zhǎng)徑＞5 cm）組（圖2h）中均未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性（均P＞0.05）。另外，在大組織、女性亞組中miR-100-5p高表達(dá)和低表達(dá)組可觀察到不同預(yù)后趨勢(shì)，雖然差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），但不能排除樣本量過(guò)少所致偏倚，需擴(kuò)大樣本量后進(jìn)一步驗(yàn)證。

表1 HCC組織miR-100-5p低表達(dá)、高表達(dá)與臨床特征的關(guān)系（例）

表2 HCC組織miR-100-5p表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系分析

圖1 miR-100-5p表達(dá)及腫瘤分期與患者預(yù)后生存的關(guān)系（a：石蠟標(biāo)本miR-100-5p低、高表達(dá)患者預(yù)后分析；b：石蠟標(biāo)本不同分期肝細(xì)胞癌患者預(yù)后分析；c：TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中miR-100-5p低、高表達(dá)患者預(yù)后分析）

3 討論

HCC作為常見的惡性腫瘤，其惡性程度高、預(yù)后差，對(duì)國(guó)民的生命健康產(chǎn)生了巨大的威脅。因此，提高HCC的診斷與治療水平有著重要的臨床意義。近年來(lái)HCC相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多新的生物標(biāo)志物，但并無(wú)哪個(gè)標(biāo)志物是完全理想的。目前，miRNA分子在HCC中的作用機(jī)制和臨床意義被許多學(xué)者所關(guān)注，多種miRNA（如miR-217、miR-148a、miR-17等[10-12]）被發(fā)現(xiàn)在HCC組織中異常表達(dá)，并和HCC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。另外，miRNA分子在體外相對(duì)穩(wěn)定，且易于檢測(cè)，有作為生物標(biāo)志物應(yīng)用于HCC診斷、預(yù)后判斷的可能。研究發(fā)現(xiàn)，miR-215、miR-150、miR-99a 等[13-15]miRNA 在 HCC組織中表達(dá)降低，miR-96、miR-155、miR-106b-5p等[14，16]在HCC組織中表達(dá)升高，這些在患者血漿或組織中異常表達(dá)的miRNA和患者臨床分期相關(guān)，這將可能用于HCC的早期診斷或靶向治療，并對(duì)判斷腫瘤的惡性程度和預(yù)后有著一定的臨床意義。

近年來(lái)，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)miR-100-5p在腫瘤中存在異常表達(dá)，并具有一定臨床意義。如在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，低表達(dá)miR-100-5p提示患者預(yù)后較差[17]。在非肌層浸潤(rùn)膀胱癌組織中，miR-100-5p低表達(dá)組的膀胱癌患者無(wú)疾病進(jìn)展時(shí)間和腫瘤特異生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于高表達(dá)組，具有臨床意義[6]。在神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，血清miR-100-5p低表達(dá)患者預(yù)后生存時(shí)間明顯低于高表達(dá)患者，這表明miR-100-5p可用于判斷患者的預(yù)后[7]。

圖2 各個(gè)不同亞組miR-100-5p表達(dá)與患者總體預(yù)后生存的關(guān)系（a：低分期亞組；b:高分期亞組；c：低齡亞組；d：高齡亞組；e：男性亞組；f：女性亞組；g：小組織亞組；h：大組織亞組）

在HCC中，已有關(guān)于miR-100功能或臨床意義的相關(guān)報(bào)道。Ge等[8]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-100可通過(guò)抑制HCC細(xì)胞自噬誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及抑制HCC細(xì)胞的增殖。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，miR-100和miR-125b可通過(guò)抑制血管生存從而抑制HCC的轉(zhuǎn)移[18]。以上研究均表明，miR-100可能作為HCC靶向治療的靶點(diǎn)之一。

前期已有Chen等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-100在HCC組織中表達(dá)降低，且是HCC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究通過(guò)石蠟標(biāo)本檢測(cè)miR-100-5p在HCC組織中的表達(dá)，并分析其表達(dá)水平和患者臨床特征間的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)低表達(dá)miR-100-5p和HCC較高的臨床分期具有相關(guān)性，且低表達(dá)miR-100-5p患者預(yù)后較差，該結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果一致。進(jìn)一步的亞組分析結(jié)果顯示，該結(jié)論在高分期、低齡、男性、腫瘤組織≤5 cm患者中依然適用。在低分期、高齡、女性、大組織亞組中，miR-100-5p表達(dá)和患者預(yù)后并無(wú)相關(guān)性。

綜上所述，本研究通過(guò)樣本檢測(cè)及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，HCC組織miR-100-5p表達(dá)水平可用于預(yù)測(cè)HCC患者預(yù)后。miR-100-5p低表達(dá)是HCC患者預(yù)后較差的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在高分期、低齡、男性、腫瘤組織≤5 cm HCC患者，miR-100-5p低表達(dá)提示著較差的預(yù)后，在女性、腫瘤組織＞5 cm HCC患者中miR-100-5p的臨床意義有待進(jìn)一步驗(yàn)證。