蔣健剛 季寧寧 杜曉馬 蘭景良 葛曉平

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是多數(shù)心血管疾病患者死亡的主要原因，隨著我國(guó)人口結(jié)構(gòu)的變化，其發(fā)生率、致殘率和致死率不斷增長(zhǎng)，嚴(yán)重影響患者健康[1]。CHF臨床癥狀缺乏特異度，合并其他疾病時(shí)其臨床表現(xiàn)更為復(fù)雜，確診和預(yù)后評(píng)估難度也更大[2]。因此，如何實(shí)現(xiàn)CHF的早期診斷、危險(xiǎn)分層并及時(shí)干預(yù)已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)[3]。microRNAs（miRNAs）是一類內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，其長(zhǎng)度為18～25核苷酸，能降解靶信使RNA（mRNA）或抑制轉(zhuǎn)錄后翻譯，從而調(diào)控基因表達(dá)[4]。miRNA-155是非編碼RNA的一種，在CHF患者中呈高表達(dá)，且其表達(dá)水平與患者疾病嚴(yán)重程度存在相關(guān)性。β-catenin是Wnt信號(hào)通路中重要的調(diào)節(jié)蛋白，在靜止細(xì)胞中可與E-Cadherin細(xì)胞內(nèi)部結(jié)合，穩(wěn)定細(xì)胞黏附，在Wnt信號(hào)激活中發(fā)揮重要作用[5-6]。本研究探討miRNA-155在CHF患者中的診斷效能及與β-catenin通路的相關(guān)性，報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇2018年4月至2020年4月金華市中醫(yī)醫(yī)院收治的CHF患者67例為觀察組，其中男40例，女 27 例，年齡 42～76（59.85±5.61）歲；冠心病 41例，高血壓病11例，擴(kuò)張型心肌病10例，風(fēng)濕性心臟病5例；心功能分級(jí) Ⅱ級(jí)26例，Ⅲ級(jí)30例，Ⅳ級(jí)11例，均經(jīng)心臟超聲、實(shí)驗(yàn)室等檢查確診[7]。并選擇同期治療的非CHF心血管疾病患者45例作為對(duì)照1組，男26 例，女 19 例，年齡 41～78（60.12±5.67）歲；冠心病 29例，高血壓7例，擴(kuò)張型心肌病6例，風(fēng)濕性心臟病3例。另選擇同期健康體檢者39例作為對(duì)照2組，其中男 21 例，女 18例，年齡 41～78（59.73±5.65）歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并結(jié)締組織疾病及急慢性感染者；（2）合并認(rèn)知功能異常、急慢性腦血管疾病者；（3）肝腎功能異?；蚝喜⒆陨砻庖呦到y(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病；（4）各種類型的腫瘤患者。3組對(duì)象性別、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究通過(guò)金華市中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（批號(hào)：20180126016）。所有對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法 3組研究對(duì)象均空腹抽取外周靜脈血5 ml，分離血清后放置在-80℃冰箱中備用。檢測(cè)方法：取300 μl血清，采用Trizol法（試劑盒購(gòu)自北京天根生化有限公司）提取總的RNA，將其溶于DRPC溶液中，用Narodrop法檢測(cè)濃度和純度。取1 μg的總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成，得到目標(biāo)cDNA后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)（試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司）。整個(gè)反應(yīng)體系總?cè)萘繛?0 μl，包括模板cDNA 1 μl、上下游引物各 1 μl、Taq 聚合酶 0.15 μl、dNTPs 1 μl、2×SYBR Green mix 10 μl加 DEPC H2O 7 μl。反應(yīng)條件為30℃下10 min；42℃下30 min；99℃下5 min；5℃下5 min，連續(xù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃溫控下延長(zhǎng)10 min。引物由上海生工生物有限公司合成，見(jiàn)表1。miRNA-155和β-catenin均選用β-actin為內(nèi)參基因，反應(yīng)結(jié)果用相對(duì)對(duì)量法（2-ΔΔCt法）計(jì)算 miRNA-155 和 β-catenin的相對(duì)擴(kuò)增倍數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組比較采用方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。繪制ROC曲線，分析miRNA-155、βcatenin mRNA通路在CHF患者中的診斷效能（靈敏度、特異度）；采用Pearson相關(guān)對(duì)CHF患者miRNA-155與β-catenin mRNA通路表達(dá)水平的相關(guān)性進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組研究對(duì)象miRNA-155、β-catenin mRNA表達(dá)水平比較 見(jiàn)表2。

表1 qRT-PCR引物序列

表2 3組研究對(duì)象miRNA-155、β-catenin mRNA表達(dá)水平比較

由表2可見(jiàn)，3組間miRNA-155和β-catenin mRNA表達(dá)水平不同，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。各組間比較發(fā)現(xiàn)，觀察組miRNA-155表達(dá)水平高于對(duì)照1組和對(duì)照2組，β-catenin mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照1組和對(duì)照2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；對(duì)照1組miRNA-155表達(dá)水平高于對(duì)照 2組，βcatenin mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05）。

2.2 miRNA-155、β-catenin mRNA通路表達(dá)水平對(duì)CHF的診斷效能 見(jiàn)表3。

表3 miRNA-155、β-catenin mRNA通路表達(dá)水平對(duì)CHF的診斷效能

由表3可見(jiàn)，miRNA-155、β-catenin mRNA 通路聯(lián)合測(cè)定對(duì)CHF患者的診斷靈敏度、特異度均高于單一miRNA-155、β-catenin mRNA通路測(cè)定，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05）。

2.3 CHF患者miRNA-155與β-catenin mRNA通路表達(dá)水平的相關(guān)性 見(jiàn)圖1。

圖1 CHF患者miRNA-155與β-catenin mRNA通路表達(dá)水平相關(guān)性

由圖1可見(jiàn)，Pearson相關(guān)分析結(jié)果表明：CHF患者miRNA-155表達(dá)水平與β-catenin mRNA通路的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.783，P＜0.05）。

3 討論

CHF是多種心臟疾病發(fā)展到后期的一種臨床綜合征，主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)耐量的顯著下降、明顯的體液潴留及乏力、納差等，其發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而顯著增加，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。因此早期準(zhǔn)確診斷和評(píng)估病情，或?qū)⒔oCHF患者帶來(lái)巨大獲益[8]。miRNAs是由18～25個(gè)核苷酸構(gòu)成的內(nèi)源非編碼單鏈小分子RNA、不僅具有結(jié)構(gòu)、序列的高度保守性，而且可以直接參與機(jī)體的發(fā)育、分化[9]。既往研究表明：miRNAs能與靶mRNA尾隨序列不完全/完全雜交方式結(jié)合，抑制mRNA的翻譯，從而發(fā)揮作用[10]。每一個(gè)miRNA能調(diào)節(jié)多個(gè)不同的mRNA表達(dá)，并且同一個(gè)mRNA亦可由多個(gè)miRNAs調(diào)節(jié)。新近研究表明[11]：miRNAs能直接參與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡，且多種疾病的病理過(guò)程均伴有miRNAs表達(dá)水平異常。由此可見(jiàn)：miRNAs能抑制下游基因表達(dá)直接參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。miRNA-155屬于miRNAs家族一員，不僅能促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成，亦可通過(guò)Rheb/mTOR調(diào)節(jié)SK6基因的表達(dá)，加劇心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展[12]。在本研究中，觀察組miRNA-155表達(dá)水平均高于對(duì)照1組和對(duì)照2組，βcatenin mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照1組和對(duì)照2組；對(duì)照1組miRNA-155表達(dá)水平高于對(duì)照2組，βcatenin mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照2組；這些均提示miRNA-155在CHF患者中呈高表達(dá)，可能可以直接參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。miRNA-155在CHF患者中呈高表達(dá)，有望成為一種全新的預(yù)測(cè)CHF病情的生物標(biāo)志物。在本研究中，ROC曲線結(jié)果表明：miRNA-155、βcatenin mRNA通路聯(lián)合測(cè)定在CHF患者中的診斷靈敏度、特異度均高于單一miRNA-155、β-catenin mRNA通路的檢測(cè)，提示miRNA-155和β-catenin mRNA通路聯(lián)合測(cè)定在CHF患者中可能獲得較高的診斷效能，或可用于指導(dǎo)臨床診療[4]。Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑由配體蛋白Wnt和膜蛋白受體構(gòu)成，能激發(fā)下游通道的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，借助細(xì)胞表面受體胞內(nèi)活化，將細(xì)胞外的信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)[13]。目前，臨床上Wnt信號(hào)途徑具有細(xì)胞間交流和自體細(xì)胞交流兩種形式，其在遺傳學(xué)上高度保守，且不同的動(dòng)物之間也較為相似[6]。而β-catenin是Wnt信號(hào)的重要組成部分，能在靜止細(xì)胞中與E-Cadherin胞內(nèi)部分相互結(jié)合，從而穩(wěn)定細(xì)胞間黏附[14]。同時(shí)，在Wnt信號(hào)激活的細(xì)胞中從胞漿進(jìn)入細(xì)胞核成為轉(zhuǎn)錄激活因子[5]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，βcatenin mRNA通路在正常人體中處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)；但是對(duì)于CHF患者，持續(xù)的應(yīng)激反應(yīng)將會(huì)下調(diào)βcatenin mRNA通路，直接參與疾病的進(jìn)展。進(jìn)一步分析CHF患者miRNA-155與β-catenin mRNA通路的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，CHF患者miRNA-155與β-catenin mRNA通路表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明CHF患者miRNA-155與β-catenin mRNA通路存在緊密聯(lián)系。因此，我們可以推斷臨床上對(duì)疑似CHF患者可進(jìn)行miRNA-155表達(dá)水平測(cè)定，從而提高CHF的早期診斷率；對(duì)于確診的心力衰竭患者應(yīng)及時(shí)采取有效的治療措施，且在治療過(guò)程中也可對(duì)患者進(jìn)行miRNA-155表達(dá)水平的測(cè)定，從而更科學(xué)地對(duì)患者預(yù)后進(jìn)行評(píng)估，使得對(duì)患者的治療更具科學(xué)性。

綜上所述，miRNA-155在CHF患者中呈高表達(dá)，且與β-catenin mRNA通路存在顯著的相關(guān)性，兩者聯(lián)合測(cè)定能獲得較高的診斷效能，值得臨床推廣應(yīng)用。