楊迪 趙瑜 馮法博 沈潔 朱丹杰 李曉林

糖尿病（diabetes mellitus,DM）[1]及肥胖[2-3]均可誘導(dǎo)晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products,AGEs）堆積，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡[4]、骨骼生物力學(xué)改變[5]，并增加骨折風(fēng)險[6]。新型降糖藥物胰高血糖素樣肽-1受體（glucagon like peptide-1 receptor,GLP-1R）激動劑具有降糖、抑制食欲、延緩胃排空、減重、改善心血管代謝功能等多項(xiàng)功能[7-9]，目前廣泛應(yīng)用于臨床。近期研究亦發(fā)現(xiàn)骨組織中存在GLP-1R，因此GLP-1R激動劑與骨代謝的關(guān)系越來越受到關(guān)注[4]。利拉魯肽（liraglutide,LIR）是GLP-1R激動劑中的一種，其和甘精胰島素（insulin glargine,GLA）作為注射類降糖藥物目前均廣泛應(yīng)用于臨床，本研究旨在探討LIR和GLA對男性2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus,T2DM）患者骨代謝的影響，并通過觀察患者血糖、BMI、骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)、骨密度（bone mineral density,BMD）的變化趨勢探討LIR是否具有骨保護(hù)作用，為口服降糖藥物治療不達(dá)標(biāo)的T2DM患者選擇更為合理的降糖方案提供理論依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018年1至6月浙江省人民醫(yī)院收治的男性T2DM患者99例，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為LIR治療組（LIR組）、GLA治療組（GLA組）和口服降糖藥物治療組（OAD組），每組 33例，隨訪 48周。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡30～50 歲男性；（2）DM 病程≤5 年；（3）BMI：20～27 kg/m2；（4）BMD Z 值＞-2.0 SD；（5） 既往磺脲類促泌劑（SU）、α-糖苷酶抑制劑（AGI）單用或聯(lián)用的T2DM患者，治療前7.0 mmol/L＜FPG＜15.0 mmol/L，并且7%＜糖化血紅蛋白（HbA1C）＜10%，空腹胰島素水平＞17.8 pmol/L，體重在篩選前至少3個月穩(wěn)定，波動＜10%。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）使用維生素D、鈣片、激素、阿侖膦酸鈉、唑來膦酸等影響骨代謝藥物；（2）入組前半年使用羅格列酮、二甲雙胍、二肽基肽酶-4抑制劑、鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2抑制劑、胰島素或GLP-1受體激動劑患者；（3）既往有脆性骨折史；（4）DM合并急性并發(fā)癥、3種及以上慢性并發(fā)癥；（5）嗜酒或吸煙量＞10 支/d；（6）合并嚴(yán)重消化道疾病和肝功能不全（ALT及AST≥3倍正常參考值），腎功能減退（肌酐≥1.5 mg/dl）；（7）Z 值≤-2.0 SD；（8）影響骨代謝的疾病如慢性腎功能不全、風(fēng)濕及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、甲狀腺功能亢進(jìn)癥、甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥和各種癌癥等繼發(fā)性骨質(zhì)疏松。隨訪過程中有9例患者脫落（LIR、GLA、OAD組各3例），其中因血糖控制不佳6例，胃腸道反應(yīng)1例，維持劑量仍出現(xiàn)低血糖1例，失訪1例。LIR組、GLA組、OAD組各30例患者完成48周隨訪。其中 LIR 組患者年齡30.9～49.1（39.88±5.77）歲，DM 病程 1.4～4.9（3.16±1.10）年；LIR 組原始方案中 18 例采用SU聯(lián)合AGI，10例單用AGI，2例單用SU；GLA組年齡 31.2～48.7（40.33±5.90）歲，DM 病程 0.7～5.0（3.19±1.23）年；GLA組原始方案中21例采用SU聯(lián)合AGI，9例單用 AGI；OAD 組年齡 31.2～48.2（39.84±5.40）歲，DM病程 1.1～4.9（3.10±1.08）年；OAD 組原始方案中 12 例采用SU聯(lián)合AGI，10例單用AGI，8例單用SU。3組患者年齡和DM病程比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)浙江省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 用藥方法 LIR組患者在原治療方案上加用LIR，LIR初始劑量0.6 mg/d；GLA組在原治療方案上加用GLA，GLA初始劑量0.2 U/（kg·d）；OAD組選擇SU格列吡嗪控釋片及AGI阿卡波糖聯(lián)用，格列吡嗪控釋片初始劑量5 mg/d，阿卡波糖初始劑量50 mg/d；若半月內(nèi)FPG及餐后2 h血糖（2 h postprandial plasma glucose,2h-PBG）控制不如預(yù)期，LIR組可考慮將LIR劑量加至1.2 mg/d；GLA組可調(diào)整GLA劑量（FPG＜4.4 mmol/L，-2 U；4.4 mol/L≤FPG≤7.0 mmol/L，不調(diào)整；7.0 mol/L＜FPG≤7.8 mmol/L，+2 U；7.8 mol/L＜FPG≤10.0 mmol/L，+4 U；FPG＞10.0 mmol/L，+6 U）；OAD 組先行調(diào)整阿卡波糖劑量后再調(diào)整格列吡嗪控釋片劑量；LIR最大劑量1.8 mg/d，GLA無最大劑量，OAD最大劑量格列吡嗪控釋片10 mg/d，阿卡波糖300 mg/d。若LIR組出現(xiàn)低血糖，先行減量格列吡嗪控釋片或阿卡波糖，后減量LIR；若GLA組出現(xiàn)低血糖，先行減量GLA，后減量格列吡嗪控釋片或阿卡波糖；若OAD組出現(xiàn)低血糖，先行減量格列吡嗪控釋片或阿卡波糖。達(dá)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)：3個月內(nèi)使患者FPG≤7.0 mmol/L，2h-PBG≤10.0 mmol/L，6個月內(nèi)HbA1C＜7.0%。退出標(biāo)準(zhǔn)：（1）3個月，LIR 加至最大劑量，GLA使用劑量＞1 U/（kg·d），OAD加至最大劑量血糖仍不達(dá)標(biāo)（FPG＞7.0 mmol/L，2h-PBG＞10 mmol/L），退出該研究。（2）若LIR、GLA和OAD最小維持劑量（LIR 0.6 mg/d、GLA 4 U/d、OAD最低劑量格列吡嗪控釋片5 mg/d或阿卡波糖50 mg/d）仍出現(xiàn)低血糖（血糖≤3.9 mmol/L）則退出該研究。

1.2.2 觀察指標(biāo) 記錄年齡、DM病程，測量身高、體重并計算BMI。觀察3組患者不良反應(yīng)情況。所有研究對象分別于治療的 0、24、48周禁食8 h后于次日清晨采集肘靜脈血，分離血清，置于-20℃冰箱儲存。采用貝克曼己糖激酶法檢測FPG及2h-PBG、利德曼直接法檢測LDL-C及TG、采用高效液相層析法檢測HbA1C，采用羅氏電化學(xué)發(fā)光法檢測骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)：骨鈣素（OC）、Ⅰ型前膠原氨基端原肽（P1NP）、Ⅰ型膠原羧基端肽β特殊序列（β-CTX）、25羥-維生素D3（25-OH-D3），采用美國GE Lunar公司的Prodigy雙能X線骨密度儀測定治療0、48周的腰椎、股骨頸和髖關(guān)節(jié)BMD。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；組內(nèi)治療前后比較采用配對t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組患者治療前后一般生化指標(biāo)比較 3組患者治療前 FPG、2h-PBG、HbA1C、BMI、TG、LDL-C 比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。3組患者治療24、48周 FPG、2h-PBG、HbA1C、TG 均較治療前顯著下降（均 P＜0.01）。3 組患者治療 24 周 2h-PBG、HbA1C、BMI、LDL-C比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），而FPG、TG比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。3組患者治療48周2h-PBG、BMI、LDL-C比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05），而 FPG、HbA1C、TG 比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。LIR組治療48周后LDLC與治療24周比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。治療24周及 48周 LIR組 BMI、2h-PBG、LDL-C均低于GLA組及OAD組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

2.2 3組患者治療前后骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)比較 3組患者治療前、治療 24 周 OC、P1NP、β-CTX、25-OH-D3比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。3組患者治療48周OC、25-OH-D3比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。LIR組治療48周OC較治療前升高（P＜0.01），治療24、48周25-OH-D3均較治療前升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；治療48周OAD組OC較治療前下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與治療24周比較，LIR組治療48周25-OH-D3明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。治療48周，與GLA組、OAD組相比，LIR組OC、25-OH-D3均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表 2。

2.3 3組患者不良反應(yīng)情況 LIR組23例（76.7%）患者出現(xiàn)了胃腸道反應(yīng)，大多數(shù)反應(yīng)輕微，主要出現(xiàn)在用藥的前4周，其中1例因出現(xiàn)難以遏制的惡心、嘔吐而退出研究；OAD組12例（40%）患者出現(xiàn)胃腸道反應(yīng)。對此LIR組5例減少了LIR的劑量，OAD組1例減少了阿卡波糖的劑量。GLA組1例患者因發(fā)生低血糖事件（隨機(jī)血糖＜3.9 mmol/L），逐步減少GLA劑量后停用GLA并退出研究?？傮w而言，整個研究過程中3組患者依從性較高。

2.4 3組患者治療前后BMD比較 3組患者治療前后腰椎、股骨頸和髖關(guān)節(jié)BMD比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表3。

表1 3組患者治療前后一般生化指標(biāo)比較

表2 3組患者治療前后骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)比較

3 討論

DM是一種以高血糖為特征的復(fù)雜代謝性疾病，高血糖導(dǎo)致的骨強(qiáng)度下降、骨骼成分變化及異常骨礦化均會引起DM患者骨折風(fēng)險增加。針對DM的治療策略不僅需強(qiáng)效控制血糖，而且還應(yīng)最大程度預(yù)防或延緩骨量丟失及骨微結(jié)構(gòu)的破壞。GLP-1R激動劑是一個兼具胰腺內(nèi)、外作用的新型降糖藥物，不但能迅速、有效降低血糖及HbA1C，而且能較好的控制血壓、血脂及體重在內(nèi)的多種心血管危險因素，并可兼顧降糖與心血管結(jié)局獲益。近年來研究發(fā)現(xiàn)GLP-1R激動劑還參與骨代謝調(diào)節(jié)，對骨微結(jié)構(gòu)、骨組織形態(tài)學(xué)均有正面影響，其可通過直接或間接作用促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收，對骨組織具有保護(hù)作用。因此GLP-1R激動劑是近年來內(nèi)分泌領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

表3 3組患者治療前后腰椎、股骨頸和髖關(guān)節(jié)BMD比較（g/cm2）

目前GLP-1R激動劑對骨代謝影響的相關(guān)研究較少，尚無統(tǒng)一結(jié)論。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞表面均表達(dá)GLP-1R[10-12]，此外研究者還在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）中檢測到了GLP-1R，并證實(shí)GLP-1R激動劑Exendin-4（EX-4）可通過激活GLP-1R調(diào)控 PKA/β-catenin和 PKA/PI3K/AKT/GSK3β信號通路促進(jìn)BMSCs成骨化，抑制BMSCs成脂化[13]，增加大鼠骨質(zhì)疏松模型中成骨細(xì)胞活性，促進(jìn)骨形成；但在許多其他類型骨細(xì)胞如鼠類MC3T3-E1成骨細(xì)胞、原代成骨、破骨細(xì)胞的研究中未檢測到GLP-1R表達(dá)，盡管未鑒定出GLP-1R，但使用GLP-1R激動劑可誘導(dǎo)小鼠前成骨樣MC3T3-E1細(xì)胞增殖及分化[14]，推測可能通過未知的糖基化磷脂酰肌醇-偶聯(lián)受體發(fā)揮影響成骨細(xì)胞分化及活性的作用；體外研究中發(fā)現(xiàn)LIR可抑制PPARγ基因表達(dá)、促進(jìn)成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2基因表達(dá)，促進(jìn)大鼠BMSCs成骨化并抑制其成脂化，推測LIR可促進(jìn)骨形成[15]。這些發(fā)現(xiàn)為GLP-1R激動劑治療骨質(zhì)疏松癥提供了分子基礎(chǔ)。動物實(shí)驗(yàn)中，去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠使用EX-4治療后，股骨及椎骨BMD呈劑量依賴性增加[16]；另分別使用EX-4及LIR干預(yù)去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠，可顯著改善其骨小梁數(shù)目、連接及結(jié)構(gòu)參數(shù)，但對皮質(zhì)骨無影響[17]；亦有研究證實(shí)LIR治療不但可增加去卵巢大鼠的小梁骨體積、厚度和數(shù)量，而且可增加皮質(zhì)骨的厚度和密度，預(yù)防骨質(zhì)疏松發(fā)生[15]。在DM動物模型中也開展了GLP-1R激動劑對骨代謝影響的研究，一項(xiàng)對鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)T1DM小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，短期GLP-1R激動劑治療雖對骨強(qiáng)度、皮質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)無顯著影響，但能顯著改善骨組織力學(xué)性能[18]；另一項(xiàng)對STZ誘導(dǎo)T2DM大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1R激動劑可通過減少骨吸收、促進(jìn)骨形成來改善股骨及腰椎骨微結(jié)構(gòu)[19]；在對去卵巢DM大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，LIR可通過激活Wnt信號通路促進(jìn)去卵巢DM大鼠成骨細(xì)胞的分化、骨基質(zhì)的形成及礦化進(jìn)而發(fā)揮骨保護(hù)作用[20]。綜上所述，體外研究及動物實(shí)驗(yàn)均提示GLP-1R激動劑具有保護(hù)骨代謝的潛能。

臨床研究中關(guān)于GLP-1R激動劑對骨代謝的影響存在爭議。在一項(xiàng)開放性、隨機(jī)、對照試驗(yàn)中[21]，將圍絕經(jīng)期非DM女性分別納入LIR組（1.2 mg）及安慰劑組，治療后安慰劑組的骨礦物質(zhì)含量顯著降低，LIR組骨形成標(biāo)志物P1NP水平增加，骨吸收標(biāo)志物CTX水平無顯著改變，BMD無統(tǒng)計學(xué)差異；另一項(xiàng)針對T2DM患者的24周研究結(jié)果顯示，治療后未觀察到GLP-1R激動劑艾塞那肽對骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)或BMD的影響[22]；LIR對糖尿病的療效與作用研究比較了T2DM患者采用不同劑量LIR（分別為1.2 mg/d及1.8 mg/d）或格列美脲（8 mg/d）干預(yù)2年，各組治療后BMD無統(tǒng)計學(xué)差異[23]；Harper等[24]在最新發(fā)表的薈萃分析中探討LIR對超重或肥胖患者骨折發(fā)生風(fēng)險及骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)LIR對超重或肥胖患者的BMD無影響，但可增加骨礦物質(zhì)含量并減少骨折風(fēng)險；Su等[25]發(fā)表的薈萃分析中同樣得出LIR治療顯著減少骨折風(fēng)險的結(jié)論，而艾塞那肽治療后存在增加骨折風(fēng)險的趨勢。總之，上述臨床研究提示GLP-1R激動劑具有部分成骨作用，但對骨吸收及BMD無顯著影響，且不同類型GLP-1R激動劑骨折風(fēng)險存在差異。

國內(nèi)外指南均推薦二甲雙胍作為T2DM的一線用藥，但體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖及分化，為避免對研究結(jié)果的干擾，故本研究中將二甲雙胍使用納入排除標(biāo)準(zhǔn)。SU及AGI為中國T2DM患者降糖治療的一線備選用藥，但單純關(guān)于SU骨骼安全性方面的研究甚少，多數(shù)為混合型研究，并且涉及磺脲類藥物對骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)及骨折風(fēng)險研究結(jié)果多數(shù)是中性的[26]。AGI在國外應(yīng)用較少，國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)其對骨代謝影響的相關(guān)報道。胰島素具有多種生物學(xué)效應(yīng)，不但能促進(jìn)機(jī)體合成代謝而且可與成骨細(xì)胞表面胰島素受體結(jié)合，促進(jìn)OC合成，減少尿鈣排泄，維持骨代謝穩(wěn)定；臨床研究發(fā)現(xiàn)胰島素治療對骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)無顯著影響[27]，但部分研究提示其可能增加T2DM患者骨折風(fēng)險，推斷與胰島素治療過程中低血糖發(fā)作引起的跌倒相關(guān)。

盡管在細(xì)胞及動物試驗(yàn)中均有證據(jù)表明GLP-1R激動劑對骨代謝有積極影響，但臨床研究中GLP-1R激動劑對骨代謝影響的相關(guān)數(shù)據(jù)仍較為缺乏，因此，本研究就LIR對男性T2DM患者骨代謝的影響進(jìn)行研究與探討。研究結(jié)果顯示，治療24及48周LIR組FPG與GLA組及OAD組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。治療24及48周LIR組BMI較GLA組及OAD組顯著下降，考慮與LIR能調(diào)節(jié)攝食中樞抑制食欲降低體重相關(guān)；治療24及48周LIR組2h-PBG較GLA組及OAD組均顯著下降，考慮與LIR不但能血糖依賴性刺激胰島素分泌、而且能延緩胃排空以及抑制餐后胰高血糖素不適當(dāng)分泌相關(guān)。本研究中監(jiān)測骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物分別為骨形成標(biāo)志物P1NP、OC和骨吸收標(biāo)志物β-CTX，另監(jiān)測25-OHD3水平變化。治療48周LIR組OC水平較基線及治療48周GLA組及OAD組均顯著升高，推測LIR具有部分促進(jìn)成骨作用；既往研究表明T2DM患者易發(fā)生25-OH-D3水平缺乏[28]，血清25-OH-D3分別與TG及LDLC、內(nèi)臟脂肪水平負(fù)相關(guān)[29-30]，維生素D缺乏不但會加快骨轉(zhuǎn)換、增加骨質(zhì)疏松風(fēng)險，而且可減少胰島素合成及分泌、降低胰島素敏感性、增加血糖血脂控制達(dá)標(biāo)難度；本研究中3組治療48周FPG及HbA1C水平無顯著差異情況下，LIR組25-OH-D3水平較基線及治療后GLA組及OAD組顯著升高，推測此結(jié)果與LIR能更好的降低LDL-C，降低內(nèi)臟脂肪相關(guān)[31]。

BMI是影響B(tài)MD的重要因素之一，研究顯示BMI與BMD呈正相關(guān)，體重對髖部及腰椎BMD均存在保護(hù)作用，具體機(jī)制考慮為多因素綜合作用結(jié)果，其中機(jī)械負(fù)荷因素為最主要的原因之一，BMI數(shù)值高的患者承受的負(fù)荷更大，骨骼負(fù)重可直接轉(zhuǎn)化為機(jī)械應(yīng)力作用于成骨和破骨細(xì)胞表面的機(jī)械應(yīng)力感受器，機(jī)械應(yīng)力進(jìn)而刺激骨形成，抑制骨吸收，從而提高骨強(qiáng)度和骨礦含量，延緩骨質(zhì)疏松的發(fā)生并降低其程度。本研究中治療后LIR組BMI水平較GLA組及OAD組均顯著下降，但腰椎、股骨及髖部BMD較GLA組及OAD組無統(tǒng)計學(xué)差異，進(jìn)一步推斷LIR對骨代謝具有積極影響。但該研究LIR 組納入患者基線 BMI：（24.21±1.81）kg/m2，治療 48周后BMI下降幅度偏小，在評估LIR對骨代謝影響有一定的局限性。

綜上，本研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)GLP-1R激動劑LIR能持續(xù)發(fā)揮控制血糖并降低體重的臨床療效。GLP-1R激動劑不但可以持久平穩(wěn)降糖，而且在降低體重、血壓、血脂等心血管風(fēng)險、保護(hù)骨代謝方面也發(fā)揮著重要作用，是T2DM患者降糖的優(yōu)先用藥選擇。但鑒于本試驗(yàn)樣本量較少，納入患者BMI水平較為局限，未來需要進(jìn)行長期更大樣本量的臨床研究探討GLP-1R激動劑對骨代謝的影響。