劉新會 羅越 林俊豪 莊雪芬 魏莉

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全球癌癥中居第5位，死亡率居第2位，每年可導致近700 000人死亡，嚴重威脅著人類的健康[1]，而其中超過50%的病例發(fā)生在我國，最新的流行病學研究發(fā)現(xiàn)肝癌已經(jīng)居我國60歲以下男性惡性腫瘤發(fā)病的首位[2-3]，因此深入探究肝癌的發(fā)病機制，尋找其潛在的診斷和治療靶點尤為重要。吲哚胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（indolethylamine N-methyl－transferase，INMT）是甲基化的催化劑，主要與大腦活動相關(guān)[4]。近年來研究認為INMT與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，INMT在多種惡性腫瘤中均表達下調(diào)[5-7]。但INMT在肝癌中的表達和臨床意義尚未見報道，其在肝癌中的作用及其機制仍不明確。癌癥相關(guān)數(shù)據(jù)庫（TCGA和GEO）可以通過對肝癌大樣本的數(shù)據(jù)分析，為INMT基因在肝癌發(fā)生、發(fā)展中作用機制的深入研究提供客觀依據(jù)。本研究采用TCGA肝癌數(shù)據(jù)庫和肝癌基因芯片GSE102079，旨在應(yīng)用生物信息學分析探討INMT在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及可能的機制，為肝癌的防治提供生物信息學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 肝癌數(shù)據(jù)庫來源 本研究從TCGA（https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structuralgenomics/tcga,TCGA-LIHC）[8]下載肝癌RNA測序數(shù)據(jù)庫及患者臨床資料，包含371例肝癌患者的癌組織以及50例肝癌患者的癌旁組織。GSE102079肝癌基因芯片數(shù)據(jù)從 GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載[9]，芯片共包含152例肝癌患者的癌組織和91例肝癌患者的癌旁組織。

1.2 INMT在肝癌數(shù)據(jù)庫的表達分析 采用R語言分析TCGA數(shù)據(jù)庫中INMT在癌組織和癌旁組織的表達情況，同時分析在GSE102079中INMT在肝癌組織和癌旁組織的表達差異，并采用Graphpad進行統(tǒng)計學分析和繪圖。

1.3 INMT表達與肝癌患者的生存分析 采用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析[10]，其中收錄了肝癌患者總生存期（overall survival,OS）、無進展生存期（progress free survival,PFS）和目的基因的表達信息，在數(shù)據(jù)庫中設(shè)置條件：Gene：INMT；Split patients by：Auto select best cutoff，分析數(shù)據(jù)庫內(nèi)INMT表達與肝癌患者OS和PFS的關(guān)系。

1.4 INMT相關(guān)基因的富集分析 采用R語言分析TCGA中INMT的相關(guān)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)和INMT顯著相關(guān)的基因303個。采用R語言分析GSE102079中INMT的相關(guān)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)和INMT顯著相關(guān)的基因421個。其中178個基因同時在兩個數(shù)據(jù)庫中為INMT相關(guān)基因（INMT-related genes,IRGS）。采用 DAVID（the Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery，http://david.abcc.ncifcrf.gov/）[11]在線分析數(shù)據(jù)庫對IRGs進行KEGG通路[12]和GO通路[13]富集分析。

1.5 INMT相關(guān)基因的蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 STRING數(shù)據(jù)庫是分析基因或蛋白相互作用的在線檢索工具，將IRGS導入數(shù)據(jù)庫，進一步構(gòu)建INMT相關(guān)基因的蛋白網(wǎng)絡(luò)，提供INMT相關(guān)蛋白的相互作用分析。

2 結(jié)果

2.1 INMT在肝癌組織和癌旁組織中的表達比較 TCGA數(shù)據(jù)庫顯示，INMT在肝癌組織中表達顯著低于癌旁組織（P＜0.01，圖1a）；進一步分析發(fā)現(xiàn)，和50例配對癌旁組織相比較，肝癌患者的癌組織中INMT仍然顯著低表達（P＜0.01，圖1b）。為了在不同肝癌數(shù)據(jù)庫中驗證INMT的表達，筆者對肝癌基因芯片GSE102079進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示和癌旁組織相比較，INMT在肝癌組織中的表達顯著降低（P＜0.01，圖1c），這提示INMT可能在肝癌中發(fā)揮抑癌基因作用。

2.2 INMT基因高表達與肝癌患者預后的相關(guān)性分析為明確INMT基因能否作為肝癌患者預后的分子標志物，筆者采用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析INMT基因表達與肝癌患者生存期的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)和INMT基因低表達組（110例）相比較，INMT基因高表達組（254例）OS顯著延長（P＜0.01，圖 2a）；和 INMT基因低表達組（176例）相比較，INMT基因高表達組（194例）PFS也顯著延長（P＜0.01，圖2b）。這提示INMT基因高表達可能作為肝癌患者預后較好的標志物。

圖1 INMT在不同肝癌數(shù)據(jù)庫中表達（a：TGCA肝癌數(shù)據(jù)庫；b：TCGA配對肝癌數(shù)據(jù)庫；c：GSE102079肝癌數(shù)據(jù)庫；**P＜0.01；INMT為吲哚胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶）

圖2 INMT高表達和低表達肝癌患者的總生存期和無進展生存期比較（a：總生存期；b：無進展生存期；INMT為吲哚胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶）

2.3 INMT在肝癌中發(fā)揮抑癌基因作用的分子機制研究 為進一步研究INMT在肝癌中發(fā)揮抑癌作用的分子機制，筆者分析發(fā)現(xiàn)TCGA和GSE102079中有178個INMT相關(guān)基因（IRGs）重疊（圖3a）。KEGG通路富集分析表明，IRGS主要涉及PI3K-AKT信號通路、細胞黏附分子、血管平滑肌收縮、腫瘤信號通路等（圖3b）；GO通路富集分析發(fā)現(xiàn)，IRGs主要涉及細胞外基質(zhì)組成、細胞黏附、血管形成等生物過程，細胞學組成分析顯示這些基因參與細胞外基質(zhì)、細胞基底膜、細胞外泌體等的組成（圖3c）。分子功能的變化主要涉及結(jié)合肝素、膠原、鈣、整合素等，還參與細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)等。

2.4 構(gòu)建肝癌中INMT相關(guān)基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)采用STRING構(gòu)建INMT相關(guān)基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖 4），發(fā)現(xiàn) COL14A1、FBLN1/2、PECAM1、EMCN、FLT4等在INMT相關(guān)基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用（圖5）。采用STRING構(gòu)建的INMT相關(guān)基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)為進一步探討INMT在肝癌中發(fā)揮作用的機制研究提供生物信息學依據(jù)。

3 討論

肝癌早期診斷具有一定的難度，大多數(shù)肝癌患者就診時已是中晚期，已經(jīng)失去根治性治療機會，病死率一直居高不下，且世界范圍內(nèi)超過50%的病例發(fā)生在我國，因此深入探究肝癌的發(fā)病機制，探索肝癌早期腫瘤標志物具有重要的臨床意義[14]。INMT和腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)INMT在多種惡性腫瘤中均表達下調(diào)[5-7，15-16]。但INMT在肝癌中的表達和臨床意義尚鮮見報道，其在肝癌中的作用及其機制仍不明確。本研究分析了肝癌TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)和肝癌患者的癌旁組織相比較，癌組織中INMT表達顯著下降，這和INMT在前列腺癌、肺癌、胃癌中表達下調(diào)一致，說明INMT可能在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用，并進一步為INMT基因在肝癌中的深入研究提供依據(jù)。

目前INMT基因在肝癌中的表達及與預后的關(guān)系尚不明確，而且INMT在腫瘤中發(fā)揮抑癌作用的機制仍缺乏深入研究。本研究進一步分析發(fā)現(xiàn)INMT高表達肝癌患者的OS和PFS顯著延長，這表明INMT基因高表達可能作為肝癌患者預后較好的標志物，可能在肝癌中發(fā)揮抑癌基因作用。進一步對兩個肝癌數(shù)據(jù)庫中的INMT顯著相關(guān)基因進行分析，篩選出178個重疊基因（IRGs）。為了進一步了解INMT相關(guān)基因，筆者對重疊基因進行進一步的KEGG和GO通路富集分析，發(fā)現(xiàn)IRGS主要涉及PI3K-AKT信號通路、細胞黏附分子、血管平滑肌收縮、腫瘤信號通路等；生物過程變化主要有細胞外基質(zhì)組成、細胞黏附、血管形成等生物過程，細胞學組成分析顯示這些基因參與細胞外基質(zhì)、細胞基底膜、細胞外泌體等的組成。分子功能的變化主要涉及結(jié)合肝素、膠原、鈣、整合素等，還參與細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)等。PI3K-AKT信號通路在肝癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其可能通過促進肝癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移發(fā)揮促癌基因作用[17-19]。而細胞外基質(zhì)以及黏附分子等也參與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移等過程[20-21]。這提示INMT可能通過參與PI3K-AKT信號通路或調(diào)控細胞外基質(zhì)以及黏附分子表達在肝癌中發(fā)揮抑癌基因作用，這為進一步探討INMT在肝癌中的作用機制提供了初步思路。

圖3 在肝癌中與INMT表達相關(guān)的基因富集分析（a：TCGA和GSE102079數(shù)據(jù)庫中INMT相關(guān)基因重疊的Venn圖；b-c：INMT相關(guān)基因的KEGG和GO富集分析；INMT為吲哚胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶）

除此之外，筆者采用STRING構(gòu)建了肝癌中INMT相關(guān)基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)COL14A1、FBLN1/2、PECAM1、EMCN、FLT4等在INMT相關(guān)基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。COL14A1是細胞外基質(zhì)的重要組成成分，而且和腫瘤進展和轉(zhuǎn)移相關(guān)。研究表明COL14A1可以顯著抑制食管癌患者的增殖和侵襲從而發(fā)揮抑癌基因作用[22-23]。筆者研究亦發(fā)現(xiàn)在肝癌中INMT和COL14A1表達呈顯著正相關(guān)。研究表明FBLN1/2、PECAM1、EMCN都是血管內(nèi)皮的重要黏附分子，參與腫瘤的血管生存和侵襲轉(zhuǎn)移[24-26]。本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)在肝癌中INMT表達和FBLN1/2、PECAM1、EMCN呈正相關(guān)，說明INMT可能通過調(diào)控肝癌微環(huán)境中黏附分子的表達，從而參與腫瘤血管形成和發(fā)生、發(fā)展。采用STRING構(gòu)建INMT相關(guān)基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)為進一步探討INMT在肝癌中發(fā)揮作用的機制研究提供生物信息學依據(jù)。

綜上所述，在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)INMT在肝癌組織中顯著低表達，INMT高表達與肝癌患者預后較好相關(guān)，可能在肝癌中發(fā)揮抑癌基因作用，INMT可以作為肝癌早期診斷和預后的一個治療靶點。此外，通過富集分析和STRING構(gòu)建INMT蛋白互作網(wǎng)絡(luò)初步探討了INMT在肝癌發(fā)揮作用的潛在機制。為深入探討INMT在肝癌中發(fā)揮抑癌基因的具體分子機制，還需要進行一系列的實驗來驗證本研究團隊的預測結(jié)果。

圖4 INMT相關(guān)基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（INMT為吲哚胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶）

圖5 TCGA-LIHC 肝癌數(shù)據(jù)庫中各基因與 INMT 相關(guān)性分析（a：COL14A1；b：FBLN1；c：FBLN2；d：PECAM1；e：EMCN；f：FLT4；INMT 為吲哚胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶）