谷建斌 張景承 薛菲 耿蘊峰 王冬冬

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，盡管診斷技術(shù)在不斷提高，以手術(shù)治療為主的綜合治療（包括化療、靶向治療等）也越來越豐富，但胃癌患者的病死率仍位居腫瘤相關(guān)死亡的第3位[1]。為了提高胃癌患者的生存期，探索胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，尋找可靠的生物標(biāo)志物作早期診斷依據(jù)和可靠的治療靶點顯得尤為迫切，因此在基因組中大量轉(zhuǎn)錄的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）成為胃癌研究的新熱點。lncRNA指長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，近年來研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在惡性腫瘤組織和正常組織中存在差異表達的lncRNA[2-3]，在多種腫瘤如胃癌、結(jié)腸癌、肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)過程中的重要作用也得到了證實[4-6]。核仁小分子RNA宿主基因3（SNHG3）是一種位于1p35.3的lncRNA。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG3在胃腺癌組織中異常高表達[7]，但目前關(guān)于lncRNA SNHG3在胃癌中發(fā)揮的作用及機制研究較少。因此，本研究主要探討下調(diào)lncRNA SNHG3的表達對人胃癌細胞增殖、侵襲、凋亡的影響及可能的機制，為胃癌的診斷和治療提供新的方向。

1 材料和方法

1.1 細胞株 人胃癌細胞株SGC-7901、正常胃黏膜上皮GES1均為河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心惠贈；人胃癌細胞MGC-803購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心；人胃腺癌細胞BGC-823購自上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 主要試劑與儀器 SNHG3-siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成。lncRNA SNHG3、β-Actin引物使用primer 5軟件設(shè)計，由上海生工公司合成。M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國promega公司；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自北京全式金公司；Lipofectamin2000購自美國 Invitrogen 公司；goat anti rabbit IgG（H+L）、辣根過氧化物酶購自美國Jackson公司；Western blot增強化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）購自美國Millipore公司。Roter gene 3000購自澳大利亞Corbett公司；NanoDrop ND-2000分光光度計購自美國NanoDrop公司；Transwell小室購自美國Corning公司；BD Accuri C6流式細胞儀購自美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 將人胃癌細胞BGC-823、SGC-7901、MGC-803及正常胃黏膜上皮細胞GES1均接種于RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后消化傳代。

1.3.2 lncRNA SNHG3相對表達量檢測 采用qRTPCR法。取對數(shù)生長期胃癌細胞BGC-823、SGC-7901、MGC-803及正常胃黏膜上皮細胞GES1，采用 qRTPCR試劑盒檢測lncRNA SNHG3的相對表達量。lncRNA SNHG3 引物：上游：5′AGACA GATTCGCAGTGGTCG3′，下游：5′GTCTCCATGGCCCACTTCTG3′；β-Actin 上游引物 5′-CACCCCAGCCATGTACGTTG-3′，下游引物 5′-AATGTCACGCACGATTTCCC-3′。采用2－ΔΔCt表示胃癌細胞 lncRNA SNHG3 相對表達量。

1.3.3 細胞分組及轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的人胃癌細胞BGC-823隨機分為SNHG3-siRNA組、陰性對照組和空白對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔。各組常規(guī)培養(yǎng)24 h，SNHG3-siRNA組加入lncRNA SNHG3-siRNA（正義鏈:5′-GCAUUUAGCUAGGAAUGCATT-3′，反義鏈：5′-UGCAUUCCUAGCUAAAUGCTT-3′）轉(zhuǎn)染，陰性對照組加入無關(guān)序列 NC-siRNA（正義鏈：5′-ACUGCGACUGCUUCACUUGTT-3′，反義鏈：5′-CAAGUGAAGCAGUCGCAGUTT-3′）轉(zhuǎn)染，空白對照組不予轉(zhuǎn)染。所有操作嚴(yán)格按Lipofectamine 2000說明書進行。轉(zhuǎn)染24 h，提取細胞總RNA，NanoDrop 2000分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測，提取的總RNA純度和完整性符合實驗要求。按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。根據(jù)SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明配制反應(yīng)體系20 μl。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 30 s，95℃ 變性10 s，60℃退火 10 s，72℃延伸20 s共40個循環(huán)。

1.3.4 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。將轉(zhuǎn)染24 h的3組細胞消化制成單細胞懸液，以5×103個/孔種植于 96孔板（100 μl/孔），在培養(yǎng) 24 h時每孔加入CCK-8 溶液 10 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 1 h，在 450 nm 波長下，用酶標(biāo)儀測定各孔光密度（OD）值。

1.3.5 細胞克隆形成能力檢測 克隆形成實驗：將細胞接種于 6孔板（1.5×104個/孔），置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 1～2周，觀察克隆細胞形成至合適大小時用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，4%多聚甲醛固定15 min，加適量0.1%結(jié)晶紫染色液染色10 min，倒置顯微鏡下觀察5個視野，計數(shù)細胞的克隆數(shù)。克隆形成率（%）=（克隆數(shù)目/接種細胞數(shù)）×100%。

1.3.6 細胞遷移能力檢測 采用Transwell小室試驗。取各組細胞，均計數(shù)5×104個細胞加入 Transwell小室上室中，用無血清培養(yǎng)液正常培養(yǎng)，小室下加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h，將小室取出用PBS沖洗，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色20 min。顯微鏡下觀察并拍照，隨機選取5個視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)，每組設(shè)3個復(fù)孔，取平均值。

1.3.7 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell小室試驗。Transwell小室上室用50 μl Matrigel膠包被，在37℃中放置3～5 h。各組分別取200 μl（密度為2.5×105個/ml）細胞接種于Transwell小室上室，在下室加入DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后擦去上室的Matrigel膠和多余細胞，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色，隨機選取5個視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)，每組設(shè)3個復(fù)孔，取平均值。

1.3.8 細胞各周期百分比及凋亡率檢測 采用流式細胞術(shù)（FCM）進行細胞周期分析，通過標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶消化程序收獲生長對數(shù)期的轉(zhuǎn)染和對照細胞，用PBS洗滌，加入500 μl PI染液和5 μl破膜劑，室溫避光孵育30 min，收集培養(yǎng)物并使用BD Accuri C6流式細胞儀分析細胞周期。數(shù)據(jù)表示為在細胞周期的G1、S和G2期細胞的百分比分布。按照細胞凋亡檢測試劑盒說明，將細胞每管加入 5 μl Annexin V-FITC 和 10 μl 20 μg/ml碘化丙啶溶液，室溫避光孵育15 min，使用流式細胞儀測定并獲取凋亡比例數(shù)據(jù)。

1.3.9 信號傳導(dǎo)與活化轉(zhuǎn)錄因子3（STAT3）、p-STAT3和基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）蛋白的表達水平檢測 采用Western blot法。使用RIPA緩沖液提取總細胞裂解物，通過配置12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS．PAGE，恒壓80 V，2 h）分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉，并在4℃下與一抗孵育過夜。緩沖液洗膜（15 min×3次），將膜與二抗孵育，最后用ECL底物試劑盒檢測，實驗重復(fù)3次。采用Bio-Rad Image Lab 5.2.1軟件進行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SAS 9.1統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA SNHG3在人胃癌細胞與胃正常黏膜上皮細胞GES1中相對表達量的比較 qRT-PCR結(jié)果顯示，與胃正常黏膜上皮細胞GES1相比，BGC-823、MGC-803細胞的lncRNA SNHG3相對表達量均明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。選取lncRNA SNHG3相對表達量最高的胃癌BGC-823細胞系進行下一步的細胞功能試驗。BGC-823細胞中，SNHG3-siRNA組lncRNA SNHG3相對表達量均明顯低于陰性對照組、空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表1 lncRNA SNHG3在人胃癌細胞與胃正常黏膜上皮細胞GES1中相對表達量的比較

表2 3組BGC-823細胞中l(wèi)ncRNA SNHG3相對表達量比較

2.2 3組BGC-823細胞增殖能力比較 結(jié)果顯示SNHG3-siRNA組的OD值均明顯低于陰性對照組、空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表3。

2.3 3組BGC-823細胞克隆形成率比較 SNHG3-siRNA組、陰性對照組、空白對照組細胞的克隆形成實驗結(jié)果見圖1（插頁）。SNHG3-siRNA組克隆形成率均明顯低于陰性對照組、空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05），見表 4。

圖1 3組細胞克隆形成能力的比較

2.4 3組BGC-823細胞遷移和侵襲能力比較 在Tran－swell遷移實驗中，SNHG3-siRNA組細胞遷移數(shù)均明顯低于陰性對照組、空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；Transwell侵襲實驗中，SNHG3-siRNA 組細胞侵襲數(shù)均明顯低于陰性對照組、空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05），見圖 2（插頁）、表 5。

表3 3組BGC-823細胞增殖能力比較

表4 3組BGC-823細胞克隆形成率比較（%）

圖2 3組BGC-823細胞的遷移、侵襲能力的比較（a：遷移實驗；b：侵襲實驗；結(jié)晶紫染色，×200）

2.5 3組BGC-823細胞各周期細胞百分比和凋亡率比較 BGC-823細胞轉(zhuǎn)染SNHG3 siRNA 24 h后，SNHG3-siRNA組細胞G1期百分比均明顯高于空白對照組、陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），3組細胞S期百分比比較差異則無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；SNHG3-siRNA組細胞G2期百分比均明顯低于空白對照組、陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖3、表6。下調(diào)lncRNA SNHG3的表達后，SNHG3-siRNA組細胞凋亡率均明顯高于空白對照組、陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖4。

表5 3組BGC-823細胞遷移、侵襲數(shù)比較（個/視野）

2.6 3組BGC-823細胞STAT3、p-STAT3和MMP-2蛋白表達水平比較 Western blot結(jié)果顯示，與陰性對照組和空白對照組比較，SNHG3-siRNA組的STAT3、p-STAT3和 MMP-2蛋白的表達水平均明顯下降，p-STAT3/STAT3的比值明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05），見圖 5、表 7。

圖3 3組BGC-823細胞各周期細胞百分比的比較

圖4 3組BGC-823細胞凋亡情況的比較

表6 3組BGC-823細胞各周期細胞百分比的比較（%）

圖5 3組BGC-823細胞STAT3、p-STAT3、MMP-2蛋白表達水平的比較（STAT3為信號傳導(dǎo)與活化轉(zhuǎn)錄因子3；MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶-2）

表7 3組 BGC-823細胞 STAT3、p-STAT3、MMP-2蛋白表達水平的比較

3 討論

目前大量研究表明，lncRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的調(diào)控作用[8-9]。lncRNA SNHG3作為一種lncRNA，最初由Pelczar等[9]發(fā)現(xiàn)。近期研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA SNHG3在肝癌、結(jié)直腸癌中均表達增高[10-11]，是肝癌、結(jié)直腸癌不良預(yù)后的重要指標(biāo)。Huang等[11]發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中，SNHG3作為內(nèi)源性競爭性RNA與miR-182-5p相互競爭，導(dǎo)致c-Myc過表達并作用于c-Myc的目的基因，從而促進了結(jié)直腸癌進展。而在胃癌的研究中，lncRNA SNHG3在胃癌組織中高表達[7]，并且高表達的胃癌患者的生存時間顯著低于低表達的胃癌患者[12]。為了進一步探討lncRNA SNHG3在胃癌中發(fā)揮的作用及機制，本研究以胃癌細胞為研究對象，qRT-PCR結(jié)果顯示，胃癌細胞BGC-823、MGC-803中l(wèi)ncRNA SNHG3的相對表達量均明顯高于胃正常黏膜上皮細胞系GES1，提示lncRNA SNHG3高表達與胃癌的發(fā)生相關(guān)。

應(yīng)用siRNA技術(shù)轉(zhuǎn)染BGC-823下調(diào)lncRNA SNHG3表達后，CCK-8實驗和克隆形成實驗結(jié)果顯示細胞增殖能力、克隆形成能力均受到顯著抑制，提示lncRNA SNHG3在胃癌發(fā)展及克隆性增殖過程中發(fā)揮了一定作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)lncRNA SNHG3表達后，G1期細胞百分比上升，G2期細胞百分比下降，提示下調(diào)lncRNA SNHG3的表達，使細胞周期阻滯于G1期，抑制胃癌細胞BGC-823進入G2期，從而抑制胃癌細胞BGC-823的分裂增殖。下調(diào)lncRNA SNHG3的表達后，BGC-823細胞凋亡率顯著上升，這些結(jié)果表明lncRNA SNHG3下調(diào)所引起的分裂增殖抑制、凋亡增加可能是胃癌細胞增殖能力下降的部分原因。Transwell遷移、侵襲實驗表明，胃癌細胞BGC-823在lncRNA SNHG3下調(diào)后的遷移及侵襲能力均顯著降低，說明在侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中l(wèi)ncRNA SNHG3可能也扮演了重要的角色。

信號傳導(dǎo)與活化轉(zhuǎn)錄因子（signal transducer andactivator of transcription，STATs）家族成員具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控雙重功能[13]。酪氨酸激酶相關(guān)受體、STATs、JAK酪氨酸激酶（Janus kinase）構(gòu)成了JAK-STAT信號通路。生理狀態(tài)下，JAK-STAT通路的激活快速而短暫，而在人類腫瘤細胞中該通路則持續(xù)激活[14]，JAK-STAT信號的異常激活可促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[15]。STAT3作為IL-6R、表皮生長因子受體、JAK、Src等多個致癌性酪氨酸激酶信號通路的會聚點，其持續(xù)性激活能上調(diào) Bcl-xl、Mcl-1、CyclinsD1/D2、C-myc 和survivin基因的表達，下調(diào)p53基因的表達，縮短細胞在G1期的停滯時間，使其快速進入S期，干擾正常細胞的增殖、分化、凋亡[16]。磷酸化后的STAT3是STAT3的活性形式，其形成二聚體后進入細胞核內(nèi)調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[17]，誘導(dǎo)多種參與細胞存活、增殖、遷移、侵襲、血管生成及免疫逃逸等基因的表達，促進致癌性轉(zhuǎn)化。抑制STAT3磷酸化及p-STAT3介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，可促進腫瘤細胞凋亡[18]。近期研究發(fā)現(xiàn)，p-STAT3蛋白與胃癌患者不良預(yù)后及胃癌分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及腫瘤浸潤深度密切相關(guān)，提示其對胃癌的發(fā)展起調(diào)控作用，可能作為預(yù)測胃癌的一個分子標(biāo)志物[19]。本研究中，下調(diào)lncRNA SNHG3表達后，STAT3、p-STAT3的表達水平顯著下降。p-STAT3/STAT3的比值顯著降低，細胞周期阻滯于G1期，細胞凋亡比例顯著上升，提示lncRNA SNHG3表達下調(diào)，可能與抑制STAT3的表達和STAT3的磷酸化水平有關(guān)，進而抑制了BGC-823細胞增殖，誘導(dǎo)了凋亡。MMP-2是MMPs家族中的重要一員，其能夠降解細胞基底膜及細胞外基質(zhì)成分Ⅳ型膠原，從而促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3可通過MMP-2啟動子上的結(jié)合位點，上調(diào)MMP-2基因表達水平，進而顯著提高胃癌細胞的轉(zhuǎn)移能力[20]。阻斷STAT3能明顯下調(diào)MMP-2蛋白的表達水平，抑制腫瘤細胞的生長和侵襲。本研究中，在下調(diào)lncRNA SNHG3表達后，STAT3、p-STAT3、MMP2 的表達水平均顯著下降，BGC-823細胞遷移及侵襲能力均顯著降低，提示可能與抑制MMP-2的表達從而抑制了BGC-823細胞的侵襲有關(guān)。這在一定程度上解釋了下調(diào)lncRNA SNHG3后細胞增殖、克隆、Transwell侵襲實驗和細胞凋亡實驗的結(jié)果，抑制lncRNA SNHG3基因有望應(yīng)用于胃癌的靶向治療。

綜上所述，本研究從細胞水平證實了lncRNA SNHG3在胃癌細胞中高表達，同時其是胃癌細胞增殖、抗凋亡、侵襲以及轉(zhuǎn)移的必要因素，對其進行干擾可以有效破壞胃癌細胞的這些生物學(xué)行為，這可能與抑制STAT3、MMP-2的表達和STAT3的磷酸化水平有關(guān)。下調(diào)lncRNA SNHG3 表達后，調(diào)控 STAT3、p-STAT3、MMP-2 表達水平的具體分子機制尚待進一步研究。