才德吉 措毛吉 萬瑪南杰

青海紅十字醫(yī)院1呼吸內科，2產科，3小兒外科（西寧810000）

非小細胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）發(fā)生率約占肺癌80%以上，5年生存率不足20%［1-2］，由于目前對肺癌的發(fā)病機制尚未明確，晚期肺癌尚無有效的化療藥物［3?4］，世界范圍內肺癌發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤第一位。腫瘤壞死因子α誘導蛋白TIPE（tumor necrosis factor?α?induced protein 8，TNFAIP8）基因家族是新發(fā)現(xiàn)的一類癌基因家族［5］，在胰腺癌、胃癌等腫瘤組織中呈高表達狀態(tài)，近年來研究表明TIPE 可能與肺癌的發(fā)生發(fā)展有關［6-7］。雖然有研究報道TIPE與肺癌細胞遷移、化療敏感性有關，但迄今為止，TIPE在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制尚未明晰。有研究發(fā)現(xiàn)TIPE 可能通過Wnt/β?catenin 信號通路調控細胞生物學特性，Wnt 信號通路是傳遞細胞生長刺激信號的一類重要通路，其異?；罨c腫瘤的生長和轉移密切相關［8］。本實驗通過沉默非小細胞肺癌A549 細胞中TIPE 基因的表達，檢測β?catenin在非小細胞肺癌細胞中的表達，為明確TIPE 基因、Wnt/β?catenin 信號通路在非小細胞肺癌中的機制研究初步奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料人非小細胞肺癌細胞系A549 購自中國科學院上海細胞庫；DMEM 培養(yǎng)基、10%胎牛血清（美國Sigma 公司）；TIPE、β?catenin 抗體（美國Abcam 公司）、流式凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；RT?PCR 逆轉錄試劑盒（美國Thermo 公司）；CCK8 試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；GFP 熒標記的shRNA?TIPE 慢病毒載體、TIPE、β?catenin、β?actin 引物序列由上海生工生物工程有限公司構建制備（表1）。

表1 TIPE、β?catenin、β?actin 引物序列Tab.1 Primer sequences of TIPE，β?catenin and β?actin

1.2 方法

1.2.1 非小細胞肺癌細胞系A549 培養(yǎng)及shRNA?TIPE 慢病毒轉染將非小細胞肺癌細胞系A549放入10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37 ℃、5%CO2。取對數(shù)生長期A549 細胞，使用感染液將細胞制成5×105個/mL 懸液種植到6 孔細胞培養(yǎng)板中，按照慢病毒轉染說明加入適量的病毒液，培養(yǎng)12 h，收集細胞3 000 r/min離心1 min，去掉上清液，更換為DMEM 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，熒光顯微鏡下觀察GFP 的表達情況，感染效率高于90%后細胞用于后續(xù)實驗，穩(wěn)定感染shRNA?TIPE 慢病毒的細胞記為shRNA?TIPE，穩(wěn)定感染shRNA 陰性對照的慢病毒記為shRNA?NC，無質粒載體的細胞為空白對照。

1.2.2 非小細胞肺癌細胞系A549內TIPE、β?catenin的表達取上述3 組細胞，加入TRIZOL 細胞裂解液，提取細胞總內RNA，根據(jù)逆轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，以β?actin 為內參，TIPE、β?catenin 引物為模板檢測mRNA 表達水平，反轉錄條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，共35 個循環(huán)，72 ℃延伸6 min。根據(jù)公式Folds=2?△△Ct計算TIPE、β?catenin 基因的相對表達量，其中△△Ct=（Ct檢測基因?Ctβ?actin）實驗組?（Ct檢測基因?Ctβ?actin）對照組，實驗重復3 次。取3 組轉染細胞，1 000 r/min 離心5 min，加入RIPA 蛋白裂解液抽提總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，每孔取50 μg 總蛋白，加上樣緩沖液100 ℃變性5 min，10%SDS?PAGE 電泳分離，電泳后轉移至NC 膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，洗膜，按順序加入一抗、二抗，ECL 顯色，Bandscan5.0 軟件對圖像進行分析，實驗重復3 次。

1.2.3 沉默TIPE基因對非小細胞肺癌細胞系A549細胞增殖、凋亡的影響CCK8 實驗取對數(shù)生長期慢病毒轉染A549 細胞，0.25%胰酶消化制備單細胞懸液，1 × 104個/孔濃度接種于96 孔板，培養(yǎng)箱中孵育0、24、48、72 h 時間點加入10 μL CCK8 試劑，繼續(xù)孵育4 h，酶標儀測定各組細胞在波長490 nm 處吸光度（OD）值，每實驗組設3 個復孔，計算細胞抑制率，細胞抑制率（%）=（1?實驗組OD值/空白對照組OD值）×100%，培養(yǎng)板四周設置空白對照孔，實驗重復3 次；細胞克隆形成實驗：取對數(shù)生長期轉染A549 細胞，1 000 個/孔接種于6 孔板，待細胞形成肉眼可見細胞克隆后加入0.1%結晶紫染色，顯微鏡下觀察并計數(shù)；細胞凋亡檢測：取上述轉染48 h 后A549 細胞，加入500 μL 的An?nexin V 緩沖液重懸細胞，Annexin V?FITC/PI 細胞凋亡試劑盒檢測各組細胞的凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學方法應用SPSS 16.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量數(shù)據(jù)采用（）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗，兩組以上間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 shRNA?TIPE 慢病毒轉染后TIPE、β?catenin表達變化shRNA?TIPE 慢病毒轉染非小細胞肺癌細胞系A549 后，TIPE mRNA 相對表達量為（0.33 ±0.07），低于陰性對照組（1.00±0.13）和空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（F=103.0，P<0.000 1）；shRNA?TIPE 轉染后，TIPE 蛋白相對表達量減少至（0.23 ±0.06），低于陰性對照組（0.75 ± 0.22）和空白對照組（0.76±0.28）（F=10.57，P=0.002 3）（圖1）。shR?NA?TIPE 轉染A549 細胞后，β?catenin mRNA、蛋白表達均低于陰性對照組和空白對照組（圖2），表明shRNA?TIPE 慢病毒感染可成功沉默TIPE 基因的轉錄和表達，同時下調A549 細胞內β?catenin mRNA 和蛋白水平。

2.2 shRNA?TIPE 慢病毒轉染后細胞增殖、凋亡變化細胞克隆形成實驗顯示TIPE 基因沉默后A549 細胞克隆形成能力顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（F= 17.48，P= 0.000 3），表明TIPE 基因能促進非小細胞肺癌細胞系A549 增殖。采用生長曲線實驗檢測沉默TIPE 基因后細胞增殖情況，沉默TIPE 基因后A549 細胞增殖能力下降（圖3）。

圖1 shRNA?TIPE 慢病毒轉染后A549 細胞內TIPE mRNA、蛋白表達變化Fig.1 The expression of TIPE mRNA and protein in A549 cells transfected with shRNA TIPE lentivirus

圖2 shRNA?TIPE 慢病毒轉染后A549 細胞內β?catenin mRNA、蛋白表達變化Fig.2 The expression of β?catenin mRNA and protein in A549 cells transfected with shRNA TIPE lentivirus

2.3 shRNA?TIPE慢病毒轉染后細胞凋亡變化為進一步確認TIPE 在A549 細胞中的致癌作用，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。見圖4，shRNA?TIPE慢病毒轉染后，A549細胞凋亡率（18.4±4.5）%明顯高于陰性對照（12.7 ± 3.6）%和空白對照組（11.5 ±3.4）%，差異有統(tǒng)計學意義（F=4.484 4，P=0.035 1），表明沉默TIPE 基因后可促進A549 細胞凋亡。

3 討論

NSCLC 包括鱗狀細胞癌、腺癌和大細胞癌，占肺癌80%以上，是癌癥主要死亡原因之一［9］。據(jù)報道中國肺癌患者中男性的發(fā)病率接近70%，女性發(fā)病率超過30%，世界范圍內每年有180 萬例肺癌新發(fā)病例和160 萬例肺癌患者死亡［10］，因此闡明肺癌發(fā)病機制刻不容緩。手術、放化療等手段是目前NSCLC 患者的主要治療方案，但局部復發(fā)、遠處轉移是NSCLC患者最終死亡的主要原因［11-12］，因此闡明肺癌發(fā)病過程中關鍵基因可能為肺癌臨床診治提供新思路。

圖3 shRNA?TIPE 慢病毒轉染后細胞增殖變化Fig.3 The change of cell proliferation after shRNA TIPE lentivirus transfection

TIPE 家族是近年來新發(fā)現(xiàn)的與腫瘤密切相關的癌基因家族，目前發(fā)現(xiàn)TIPE 家族成員包括TIPE、TIPE1、TIPE2、TIPE3，TIPE 是首先被發(fā)現(xiàn)的家族成員，參與細胞凋亡、腫瘤細胞增殖等生物學過程［13］。有研究發(fā)現(xiàn)TIPE 在多種實體腫瘤中呈高表達狀態(tài)，TIPE 的表達水平與腫瘤的TNM 分期相關［14-15］。TIPE 家族成員具有高度同源性的序列，其核酸序列的氨基末端包含一個死亡效應結構域（death effector domain，DED），DED 通過Fas 結合調節(jié)細胞凋亡［16-17］。有學者通過構建TIPE 過表達質粒載體轉染人宮頸癌細胞Hela 細胞，結果發(fā)現(xiàn)未轉染的Hela 細胞的亞G1 期細胞數(shù)量增加，轉染的Hela 細胞由G1 期向S 期轉變，進一步發(fā)現(xiàn)TIPE 的DED 能負向抑制Caspase 介導的細胞凋亡［18-19］。本研究通過構建shRNA?TIPE 慢病毒轉染非小細胞肺癌細胞系A549 后，A549 細胞克隆形成能力、增殖能力下降，A549細胞凋亡率（18.4±4.5）%明顯高于陰性對照（12.7 ± 3.6）%和空白對照組（11.5 ±3.4）%，差異有統(tǒng)計學意義（F=4.484 4，P=0.035 1），表明TIPE 基因具有促進A549 細胞增殖、抑制凋亡的作用，然而其機制原因尚未完全明確。既往研究證實β?catenin 信號通路的異?；罨c肺癌發(fā)生發(fā)展密切相關，Wnt/β?catenin 通路是Wnt 信號在細胞質中傳遞的經典途徑，β?catenin 更是該信號調控通路中的核心，其表達量或活性改變將直接影響Wnt/β?catenin 信號通路的功能［20］。研究證實NSCLC 組織、細胞中Wnt/β?catenin 信號呈異?；罨癄顟B(tài)，其異?；罨癄顟B(tài)受c?Myc、p53 等癌基因表達調控［21］，且異?；罨摩?catenin 使肺癌細胞具有更強的增殖、遷移、侵襲和抗凋亡能力［22］。本研究發(fā)現(xiàn)shRNA?TIPE 慢病毒轉染非小細胞肺癌細胞系A549 后，TIPE 和β?catenin mRNA、蛋白表達均下降，表明shRNA?TIPE 慢病毒感染可成功沉默TIPE 基因的轉錄和表達，同時下調A549 細胞內β?catenin mRNA 和蛋白表達水平。本研究初步探討TIPE 下調Wnt/β?catenin 信號通路對非小細胞肺癌細胞系A549 增殖、凋亡的影響，推測TIPE 可能通過Wnt/β?catenin 參與肺癌的發(fā)生發(fā)展過程。

綜上所述，TIPE可能通過激活Wnt/β?catenin信號通路促進非小細胞肺癌細胞系A549細胞增殖，抑制凋亡，通過構建shRNA?TIPE 慢病毒進一步明確了TIPE、β?catenin 在肺癌發(fā)生發(fā)展中作用機制，為后續(xù)NSCLC發(fā)病機制的研究提供了新的研究方向。