王婧 楊雯 涂琦 江堅青

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢兒童醫(yī)院，武漢市婦幼保健院產(chǎn)科（武漢430040）

宮頸癌的耐藥性導致臨床治療效果差，成為發(fā)展中國家宮頸癌發(fā)病率高、病死率高的主要原因［1-2］。因此，尋找有效的宮頸癌治療方法迫在眉睫。燈盞花素是首次從石胡荽中提取的倍半萜內(nèi)酯，具有抑制多種腫瘤細胞增殖的作用［3-5］。以往的研究表明，燈盞花素的抗腫瘤活性與破壞線粒體氧化還原狀態(tài)的穩(wěn)態(tài)有關(guān)［6］。然而，燈盞花素在宮頸癌中的詳細機制仍需進一步研究。最近研究［7］表明，PTEN 誘導假定激酶1（PTEN?induced putative kinase 1，PINK1）/E3 泛素連接酶（E3 ubiq?uitin protein ligase，Parkin）介導的有絲分裂在線粒體功能障礙和細胞凋亡中起重要作用，并且已有研究闡明了PINK1 在多種癌細胞中的作用。因此，本研究探討了燈盞花素對HeLa 細胞增殖、凋亡、ROS 產(chǎn)生和線粒體功能障礙的作用及其潛在的分子機制是否與PINK1/Parkin 信號通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)與試劑人宮頸癌細胞系HeLa購自美國ATCC 公司和人正常宮頸上皮細胞（HcerEpic）購自廣州萊德爾生物科技有限公司。將這些細胞接種在含有10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素的Dulbecco 改良的Eagle′s 培養(yǎng)基（DMEM，均購自美國Gibco 公司）中培養(yǎng)。燈盞花素（純度> 98%）購自美國Sigma Aldrich 公司。

1.2 MTT試驗將HeLa細胞接種于96孔板（3 000個/孔）中。經(jīng)過各種處理后，用含有MTT（0.5 mg/mL）的培養(yǎng)基代替細胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)4 h 后，取上清液，加入150 μL 二甲基亞砜。測定570 nm 處的吸光度。

1.3 細胞凋亡分析收集HeLa 細胞，用70%乙醇在4 ℃下固定2 h，然后照細胞周期和凋亡分析試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）說明進行染色。用流式細胞術(shù)分析染色細胞。

1.4 乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）釋放測定為了進行LDH 測定，將每個樣品的上清液與NADH 和丙酮酸鹽在37 ℃孵育15 min，然后加入0.4 mol/L NaOH 終止反應。測定490 nm 處的吸光度計算LDH 活性。

1.5 ROS 生成的測定使用DCFH?DA 熒光探針（上海凱根生物科技有限公司）檢測細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。將細胞與DCFH?DA 在37 ℃黑暗中染色30 min。通過共焦顯微鏡檢測綠色熒光強度。

1.6 ATP 合成的測量通過MAK190 ATP 檢測試劑盒（美國Sigma?Aldrich 公司）測定HeLa 細胞中的ATP 合成。將HeLa 細胞進行裂變，離心5 min，將100 μL 上清液與100 μL 的ATP 工作稀釋液混合。測定340 nm 處的吸光度。

1.7 線粒體腫脹的測定用線粒體分離試劑盒（美國Thermo Scientific 公司）分離線粒體。首先，用胰蛋白酶處理細胞，離心，將分離的線粒體懸浮在新鮮的溶脹緩沖液中，濃度為0.5 mg/mL。加入CaCl2（200 μmol/L），并通過監(jiān)測540 nm 處的吸光度在20 min 內(nèi)變化計算線粒體的腫脹。

1.8 短干擾RNA（siRNA）和轉(zhuǎn)染靶向特異PINK1?siRNA 慢病毒（Si?PINK1，序列：5′?ACATAACGAA?TCACTCGTTAT GA?3′）和對照siRNA（Si?NC，序列：5′?GACGTGGAACGTTCTTCATTTTT?3′）購自美國Santa Cruz 公司。使用Lipofectamine 2000（美國Invitrogen 公司）在6 孔板中進行瞬時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h 后，收集細胞用于實驗。

1.9 Western blot分析用RIPA裂解緩沖液從HeLa細胞中提取總蛋白，然后通過電泳分離轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h后，將膜與一抗Parkin（1∶500），Bax（1∶500），Bcl?2（1∶1 000），PINK1（1∶800），Cleaved caspase?3（1∶1 000），Cyt C、Cyto Cyt C、Mito Cyt C（1∶1 000）或β?actin（1∶2 000，均購自美國Cell Signaling 公司）在4 ℃下孵育過夜。然后，將膜洗滌并與抗小鼠或抗兔二抗在室溫下孵育1 h。用ECL Plus 可視化蛋白質(zhì)條帶。

1.10 統(tǒng)計學方法使用GraphPad Prism 5.0 軟件進行統(tǒng)計分析。組間比較采用單因素方差分析和t檢驗進行。當P< 0.05 時，認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 燈盞花素抑制宮頸癌細胞的存活并誘導其凋亡如圖1A 和B 所示，燈盞花素以時間和劑量依賴性方式顯示出對細胞活力的顯著抑制作用（P<0.001），并且處理24 h 的抑制效果好于12 h。然而，燈盞花素對正常人細胞HcerEpic 的細胞毒性很小，低于HeLa（IC50=112.1 nmol/L）細胞（圖1C）。LDH 測定表明，在相同處理條件下，HeLa 細胞的LDH 泄漏量顯著增加（P<0.01）（圖1D）。此外，用燈盞花素治療24 h后，凋亡細胞數(shù)量明顯增加，呈劑量依賴性（圖1E）。與對照組相比，用120 nmol/L 燈盞花素治療可顯著提高凋亡細胞百分率（16.8 倍）（P<0.001）。

2.2 燈盞花素誘導宮頸癌細胞氧化應激和線粒體功能障礙如圖2A 和B 所示，與對照組相比，隨著燈盞花素濃度的增加，綠色熒光強度逐漸增強（增加百分率分別為145%、184%和231%）。在燈盞花素處理的細胞中觀察到ATP 生成減少（減少百分率分別為85%、62%和41%）（圖2C）。此外，隨著燈盞花素濃度的增加，HeLa 細胞線粒體腫脹逐漸增加，表現(xiàn)為吸光度降低。

2.3 燈盞花素對線粒體功能障礙的特異性蛋白表達影響在HeLa 細胞中，Bax/Bcl?2 的比例、Cyt C和Cleaved caspase?3 隨燈盞花素濃度的增加而上調(diào)。同時，燈盞花素處理后，Cyto Cyt C 的釋放顯著增強（P< 0.01），而Mito Cyt C 的水平明顯降低（P<0.01）（表1）。

圖2 燈盞花素誘導宮頸癌細胞氧化應激和線粒體功能障礙Fig.2 Brevilin induces oxidative stress and mitochondrial dysfunction in cervical cancer cells

2.4 燈盞花素抑制宮頸癌細胞中的PINK1/Parkin途徑Western blot 分析（圖3A?B）顯示，與對照組相比，燈盞花素治療后PINK1（減少百分率分別為84%、61%和38%）和Parkin（減少百分率分別為80%、54%和31%）蛋白表達水平顯著降低（P<0.01）。進一步研究發(fā)現(xiàn)，通過PINK1 敲低上調(diào)了HeLa 細胞 中Bax/Bcl?2 比 例、Cleaved caspase?3、Cyt C 和Cyto Cyt C 蛋白表達，并下調(diào)了Mito Cyt C蛋白表達，表明抑制PINK1 表達有助于Cyt C 從線粒體釋放到細胞質(zhì)中（圖3C）。此外，功能學評價顯示，PINK1 敲低顯示出對HeLa 細胞活力的顯著抑制作用（降低百分率為49%），并提高凋亡細胞百分率和ROS（增加百分率為221%）的產(chǎn)生（圖3D?F）。

表1 燈盞花素對線粒體功能障礙的特異性蛋白表達影響Tab.1 Effect of brevilin on specific protein expression of mitochondrial dysfunction±s

表1 燈盞花素對線粒體功能障礙的特異性蛋白表達影響Tab.1 Effect of brevilin on specific protein expression of mitochondrial dysfunction±s

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

Bax/Bcl?2Cyt C/β?actin Cleaved caspase?3/β?actin Cyto Cyt C/β?actin Mito Cyt C/β?actin 組別Control Brevilin（30 nmol/L）Brevilin（60 nmol/L）Brevilin（120 nmol/L）1.00±0.04 1.96±0.09**4.12±0.28***6.18±0.33***1.00±0.02 1.48±0.15*1.86±0.20*2.22±0.23**1.00±0.04 1.65±0.11*1.94±0.23*2.37±0.28**1.00±0.02 1.25±0.13 1.71±0.19*2.12±0.26**1.00±0.02 0.86±0.07 0.61±0.08*0.44±0.05**

圖3 燈盞花素抑制宮頸癌細胞中的PINK1/Parkin 途徑Fig.3 Brevilin inhibits PINK1/Parkin pathway in cervical cancer cells

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，燈盞花素在正常HcerEpic 細胞中具有低細胞毒性，而在Hela 細胞中具有時間和劑量依賴性的抗癌作用。先前的研究［8-9］報道，燈盞花素對三陰性乳腺癌細胞的細胞毒性高于對正常細胞系的細胞毒性。據(jù)報道［10］，天然化合物對癌細胞的抑制作用與細胞凋亡有關(guān)。本研究中，燈盞花素有效促進了Hela 細胞凋亡。在大多數(shù)癌細胞中，ROS 的過度產(chǎn)生是典型的凋亡現(xiàn)象［11-12］。HeLa 細胞暴露于燈盞花素后，ROS 水平升高并呈劑量依賴性，這導致LDH 的高釋放速率和脂質(zhì)過氧化程度。此外，細胞凋亡是由多種凋亡相關(guān)基因調(diào)控的細胞程序性死亡，越來越多的證據(jù)支持線粒體信號通路在天然化合物觸發(fā)的細胞凋亡中起關(guān)鍵作用［13-14］。Bax、Bcl?2 等凋亡蛋白改變了線粒體膜通透性，釋放Cyt C，激活Caspase?3，導致細胞凋亡［9］。本研究中，HeLa 細胞暴露于燈盞花素會導致Bax/Bcl?2 比例上調(diào)，并且Cyt C 從線粒體到細胞質(zhì)的釋放量增加以及Caspase?3 級聯(lián)被激活，進而誘導HeLa 細胞凋亡。這些結(jié)果表明線粒體信號通路介導了燈盞花素誘導的HeLa 細胞凋亡。

最近的研究［15-19］證實，PINK1/Parkin 信號通路在線粒體功能障礙和細胞凋亡中起樞軸作用。YAO 等［16］證明，敲低PINK1 可以顯著抑制宮頸癌細胞的癌相關(guān)表型并阻斷細胞周期進程。此外，在宮頸癌中，PINK1 表達增加，促進癌細胞惡性增殖和化療耐藥［20］。本研究中，燈盞花素治療后PINK1 和Parkin 蛋白表達水平較對照組顯著降低。此外，PINK1 基因敲除與燈盞花素治療產(chǎn)生了類似的體外活性結(jié)果。所有這些數(shù)據(jù)表明燈盞花素介導的線粒體功能誘導人宮頸癌HeLa 細胞凋亡至少部分歸因于PINK1/Parkin 途徑抑制。

綜上所述，燈盞花素治療抑制了PINK1/Parkin通路，從而抑制HeLa 細胞活力，提高凋亡細胞百分率和促進ROS 產(chǎn)生。這些數(shù)據(jù)支持燈盞花素成為一種新的抗宮頸癌藥物。