殷荷 王艷華 吳琪瑞 張輝 高麗娜 朱亞飛 張慧萍，吳凱 姜怡鄧

寧夏醫(yī)科大學(xué)1臨床醫(yī)學(xué)院，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（銀川750004）；3寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院（銀川750004）；4國家衛(wèi)生健康委代謝性心血管疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（銀川750004）；5寧夏血管損傷與修復(fù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（銀川750004）

子癇前期（preeclampsia，PE）是一種妊娠期女性出現(xiàn)的高血壓、蛋白尿等多種癥狀并存的母嬰共患疾病，嚴(yán)重威脅母嬰健康，其發(fā)病機(jī)制至今仍不明確且尚無有效的防治措施［1］。因此，探索PE 的發(fā)病機(jī)制及新的防治手段成為產(chǎn)科醫(yī)務(wù)工作者面臨的新難題。自噬是一種進(jìn)化上保守的機(jī)制，用來維持細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡［2］。目前，自噬在腫瘤、退行性疾病和心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中備受關(guān)注［3］；近年來，自噬在PE 過程中的作用也逐漸受到重視［4］。研究［5］證實(shí)，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞自噬水平的異常與多種妊娠并發(fā)癥有關(guān)，如PE、胎兒生長受限、早產(chǎn)和流產(chǎn)等。然而，其具體作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。microRNA（miRNA）是指能夠負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的單鏈非編碼小分子，在多種疾病中起著重要作用［6-7］。許多研究［8］證實(shí)，PE 患者存在多種miRNA 的差異表達(dá)，到目前為止，只有少數(shù)miRNA的作用被證實(shí)。其中，miR?5088?5p 在PE 發(fā)生、發(fā)展過程中的作用未見報(bào)道，仍需進(jìn)一步探討。因此，本研究以胎盤組織和滋養(yǎng)細(xì)胞為研究對(duì)象，檢測(cè)miR?5088?5p 在PE 患者胎盤組織中的表達(dá)及在PE 診斷中的臨床價(jià)值；同時(shí)，體外缺氧誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生自噬，模擬PE 發(fā)生發(fā)展的病理環(huán)境，通過過表達(dá)miR?5088?5p，檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的變化，從而揭示miR?5088?5p 在PE 發(fā)病過程中的作用機(jī)制，為PE 的早期診斷及治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料HTR?8/SVneo 人源胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞株（上海，瑞鹿）；胎牛血清、RPMI?1640 培養(yǎng)基（美國，Gibco）；青鏈霉素、胰蛋白酶消化液（北京，solarbio）；miR?5088?5p mimics 及miR?5088?5p NC（上海，吉碼）；總蛋白提取試劑盒（上海，貝博）；LC3B 兔抗人一抗（美國CST 公司，2775）；p62 兔抗人一抗（美國abcam 公司，ab109012）；β?actin（美國Santa，sc?47778HRP）；CK?7鼠抗人一抗（美國abcam公司，ab9021）；總RNA提取試劑盒（北京，天根）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒（日本，Takara）；miR?5088?5p、U6 引物（廣州，銳博）。

1.2 方法

1.2.1 研究對(duì)象及組織標(biāo)本選取2013年1月至2015年2月在寧夏國龍婦產(chǎn)醫(yī)院分娩的PE 孕婦25 例（PE 組），同期健康妊娠分娩的孕婦25 例（PC 組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：妊娠20 周后出現(xiàn)收縮壓≥140 mmHg 和/或舒張壓≥90 mmHg，同時(shí)伴有蛋白尿（尿蛋白≥0.3 g/24 h 或尿蛋白肌酐比值≥0.3 或隨機(jī)尿檢≥+），且無消耗性疾病。組織標(biāo)本收集前征得所有孕產(chǎn)婦同意并簽署知情同意書，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2.2 qRT?PCR 檢測(cè)胎盤組織miR?5088?5p 的表達(dá)根據(jù)總RNA 提取試劑盒說明書提取PE 組和PC 組胎盤組織的總RNA，取1 μg 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，總體系為20 μL，以U6 作為內(nèi)參，檢測(cè)miR?5088?5p 的表達(dá)。PCR擴(kuò)增程序：采用兩步法，95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，共45 個(gè)循環(huán)；熔解曲線95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。使用2?ΔΔCt法統(tǒng)計(jì)基因的相對(duì)表達(dá)量，ΔΔCt=［Ct miR?5088?5p（待測(cè)樣本）-Ct U6（待測(cè)樣本）-［Ct miR?5088?5p（校正樣本）-Ct U6 校正樣本）］。

1.2.3 免疫熒光檢測(cè)胎盤組織LC3B 及p62 的表達(dá)胎盤組織按照常規(guī)方法制備蠟塊，石蠟切片厚度4 μm。石蠟切片脫蠟至水，用枸櫞酸溶液高溫修復(fù)抗原，恢復(fù)至室溫后，PBS 洗5 min×3 次；3%H2O2室溫孵育30 min，滅活內(nèi)源性酶，PBS洗5 min×3次；0.5%TritionX?100室溫孵育8 min，PBS洗5 min×3次；山羊血清室溫孵育60 min，棄去血清，分別將稀釋后的CK?7 一抗與LC3B 或p62 一抗混合，均勻滴加于切片，4 ℃孵育過夜；PBS洗5 min×3次；加入熒光二抗，室溫避光孵育2 h，PBS洗5 min×3次；DAPI染細(xì)胞核，PBS洗5 min×3次后，滴加抗熒光猝滅劑封片，快速于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)HTR?8/SVneo 細(xì)胞接種于25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，給予含10%胎牛血清、100 μg/mL青鏈霉素的RPMI?1640 培養(yǎng)基5 mL，置于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每2 ～3 d 用0.25 %胰蛋白酶消化傳代1 次，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞密度達(dá)60%～70%時(shí)，嚴(yán)格按Lipofectamine2000 說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，將miR?5088?5p mimics 及miR?5088?5p NC 分別轉(zhuǎn)染至HTR8/Svneo 細(xì)胞，各分為2 組進(jìn)行培養(yǎng)：正常組（nomorxia）：在37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)；缺氧組（hypoxia）：在NAPCO Series 8000WJ培養(yǎng)箱中以37 ℃、1%O2和5%CO2的條件下培養(yǎng)。另外設(shè)立空白對(duì)照組（未進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作的自然生長HTR8/Svneo 細(xì)胞），各組均重復(fù)三次。

1.2.6 Western blot測(cè)定LC3B和p62蛋白表達(dá)收集各組滋養(yǎng)細(xì)胞后提取總蛋白；取30 μg 蛋白樣品于12 %分離膠和4 %濃縮膠進(jìn)行SDS?PAGE 電泳；將蛋白質(zhì)濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜；用5 %脫脂牛奶封閉2 h；加入一抗4 ℃孵育過夜；PBST 洗滌10 min×3 次；加入HRP 標(biāo)記的二抗（均1∶5 000），室溫孵育2 h；PBST 洗滌10 min×3 次；ECL 化學(xué)發(fā)光顯色，分別以LC3BⅡ/Ⅰ灰度值比值作為LC3B 蛋白的表達(dá)量，p62 灰度值與內(nèi)參β?actin 灰度值比值作為p62 蛋白的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用Prism 6.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料兩組對(duì)比采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)間比較采用One?way ANOVA 檢驗(yàn)，相關(guān)性分析以pearson 相關(guān)系數(shù)表示，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象臨床資料的分析與PC 組比較，PE 組年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），而孕周、收縮壓、舒張壓、血小板計(jì)數(shù)及新生兒體重差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 研究對(duì)象臨床資料分析Tab.1 Analysis of clinical data of study subjects±s

表1 研究對(duì)象臨床資料分析Tab.1 Analysis of clinical data of study subjects±s

年齡（歲）孕周（周）收縮壓（mmHg）舒張壓（mmHg）血小板計(jì)數(shù)（×109/L）新生兒體重（g）PC（n=25）27.80±0.94 39.60±0.19 115.20±1.54 74.80±1.31 181.44±7.79 3 414.00±95.02 PE（n=25）26.28±0.92 38.44±0.43 145.20±2.89 97.00±1.47 207.12±11.36 3 114.00±165.49 P 值0.2533 0.0151<0.001<0.001 0.0228 0.0126

2.2 miR?5088?5p 在胎盤組織中的表達(dá)通過qRT?PCR 檢測(cè)胎盤組織中miR?5088?5p 表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與PC 組比較，PE 組胎盤組織中miR?5088?5p表達(dá)明顯下調(diào)（P< 0.01），提示miR?5088?5p 可能在PE 發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，見圖1。

圖1 qRT?PCR 檢測(cè)胎盤組織miR?5088?5p 的表達(dá)Fig.1 qRT?PCR detection of miR?5088?5p expression in placenta

2.3 miR?5088?5p 表達(dá)水平與研究對(duì)象臨床特征的相關(guān)性分析為了初步探討miR?5088?5p 與PE的關(guān)系，進(jìn)行pearson 相關(guān)性分析（見圖2）。miR?5088?5p 的表達(dá)水平與收縮壓（r=-0.5 758）、舒張壓（r=-0.6 125）和血小板計(jì)數(shù)（r=-0.6 082）均呈負(fù)相關(guān)（P< 0.05）；相反，與新生兒體重呈正相關(guān)（r= 0.6 458），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），進(jìn)一步證實(shí)miR?5088?5p 在PE 發(fā)生發(fā)展中的重要作用。

圖2 miR?5088?5p 的表達(dá)水平與臨床特征的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis between the expression level of miR?5088?5p and clinical features

2.4 胎盤組織及胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中LC3B 和p62 蛋白的表達(dá)胎盤組織免疫熒光結(jié)果顯示：與PC 組比較，PE 組LC3B 蛋白表達(dá)明顯增加，而p62 蛋白表達(dá)減少；同時(shí)，體外缺氧干預(yù)滋養(yǎng)細(xì)胞48 h后，與Nomorxia 組比較，Hypoxia 組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞LC3BⅡ/Ⅰ表達(dá)增加（P<0.05），而p62 蛋白表達(dá)降低（P< 0.05），與組織水平一致，提示在PE 的發(fā)病過程中伴隨著自噬的發(fā)生，而體外缺氧干預(yù)滋養(yǎng)細(xì)胞可以模擬PE 發(fā)生自噬的病理過程，見圖3。

2.5 過表達(dá)miR?5088?5p后胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞自噬的改變?yōu)檫M(jìn)一步探討miR?5088?5p的作用，將miR?5088?5p mimics 轉(zhuǎn)染胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞，同時(shí)分為Nomorxia組和Hypoxia 組，培養(yǎng)48 h 后應(yīng)用Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞LC3B 和p62 蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示：在Nomorxia 組中，轉(zhuǎn)染miR?5088?5p mimics 后的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞LC3BⅡ/Ⅰ表達(dá)降低（P<0.001），p62蛋白表達(dá)增加（P<0.05），自噬水平降低；同時(shí)，Hypoxia組中亦發(fā)現(xiàn)相同的自噬水平變化，提示miR?5088?5p可抑制缺氧所致的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生自噬，從而抑制PE的發(fā)生發(fā)展，見圖4。

3 討論

圖3 胎盤組織及胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中LC3B 和p62 蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of LC3B and p62 proteins in placental tissues and placental trophoblasts

圖4 miR?5088?5p 過表達(dá)后檢測(cè)其自身和LC3B、p62 蛋白的表達(dá)Fig.4 Detection of miR?5088?5p and LC3B，p62 protein expression after overexpression miR?5088?5p

近年來，PE 的發(fā)病率和病死率逐年上升［9-10］。然而，PE 的發(fā)病機(jī)制至今仍不明確。胎盤是母體與胎兒間進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)交換的特有器官，臨床資料顯示，隨著胎兒和胎盤的娩出，PE 的臨床癥狀可迅速恢復(fù)正常，可見，胎盤在PE 的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［11-12］。滋養(yǎng)細(xì)胞是胎盤的主要功能細(xì)胞，是妊娠維持和穩(wěn)定的基礎(chǔ)［9］。研究［13］證實(shí)，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞功能異常與PE 的發(fā)展過程密切相關(guān)。

自噬廣泛存在于真核細(xì)胞中，參與多種細(xì)胞的生理病理過程，受多種分子機(jī)制調(diào)控［14］。研究［15］證實(shí)，自噬可在受精、胎盤形成和分娩多個(gè)過程中影響妊娠的發(fā)生和維持，但目前關(guān)于自噬調(diào)節(jié)PE 發(fā)病的具體機(jī)制尚不清楚。因此，本研究為了探討自噬在PE 發(fā)生發(fā)展中的作用，將CK?7 分別與LC3B 和p62 共同定位，胎盤組織免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LC3B 在滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)增加，而p62 表達(dá)減少；同時(shí)，通過體外缺氧刺激胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞，模擬PE 發(fā)生微環(huán)境，發(fā)現(xiàn)與Nomorxia 組比較，Hypox?ia 組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達(dá)增加，而p62 蛋白表達(dá)降低，與PE 胎盤組織中自噬水平變化一致，提示自噬參與了PE 的病理過程，但具體調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

miRNA 是長約22 nt 的小非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)變化［16］。同時(shí)，miRNA 參與調(diào)節(jié)各種生理病理過程中的不同信號(hào)通路，受到學(xué)者的廣泛關(guān)注［17］。研究［18-19］表明，孕婦在懷孕期間，受心血管并發(fā)癥的影響，各種循環(huán)miRNA表達(dá)異常。研究［20］發(fā)現(xiàn)，miR?133b 在PE 中表達(dá)下調(diào)，可通過抑制SGK1 促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，進(jìn)而參與PE 的發(fā)生發(fā)展；提示miRNA可能通過影響滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、凋亡、自噬、侵襲和遷移等生物學(xué)行為，推動(dòng)PE 的發(fā)生與發(fā)展［21］。課題組［22］前期也已發(fā)現(xiàn)miR?5088?5p 在缺氧誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)降低，但是其在PE 中的具體作用仍不清楚。因此，本研究首先通過qRT?PCR 在25 例PC 組和25 例PE 組胎盤組織中檢測(cè)miR?5088?5p 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR?5088?5p 在PE 中明顯下調(diào)，提示miR?5088?5p 可能在PE 發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，與以往文獻(xiàn)得出的結(jié)論一致；然后，分別將miR?5088?5p 的表達(dá)水平與PC 組及PE 組臨床特征進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)miR?5088?5p 與收縮壓、舒張壓及血小板計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)，與新生兒體重呈正相關(guān)，說明miR?5088?5p 的異常表達(dá)與PE 密切相關(guān)。同時(shí)，為進(jìn)一步探討miR?5088?5p 在PE 自噬中的作用，體外將miR?5088?5p mimics 轉(zhuǎn)染滋養(yǎng)細(xì)胞，缺氧培養(yǎng)48 h 后，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR?5088?5p 后，LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達(dá)降低，p62 蛋白表達(dá)增高，自噬水平明顯降低。表明miR?5088?5p可以抑制胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞自噬發(fā)生。在PE缺氧模型中轉(zhuǎn)染miR?5088?5p mimics，發(fā)現(xiàn)自噬過程同樣被抑制。這些研究結(jié)果提示miR?5088?5p 可以抑制胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞自噬發(fā)生，從而抑制PE 的發(fā)生發(fā)展。但是，由于標(biāo)本數(shù)量有限，少量的樣本尚不能代表全部的臨床病例，因此，后續(xù)將擴(kuò)大樣本數(shù)量進(jìn)一步驗(yàn)證，并在血清中探索miR?5088?5p 在PE 疾病中的診斷價(jià)值。

綜上所述，研究結(jié)果表明miR?5088?5p 在PE中表達(dá)降低，并與PE 的臨床特征密切相關(guān)，可作為一種保護(hù)性因子，抑制PE 胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞自噬的發(fā)生，延緩PE 的發(fā)生發(fā)展。這為PE 發(fā)病機(jī)制的研究開拓了一個(gè)全新的視角，為研究人員探究PE胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞自噬過程中miRNA 的調(diào)控機(jī)制提供了新的思路。并且，由于miR?5088?5p 特殊的生物學(xué)功能，它可作為調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞自噬的關(guān)鍵基因，對(duì)其具體機(jī)制的進(jìn)一步研究，將為臨床預(yù)防及早期診斷PE 提供重要的理論依據(jù)。