王俊瑤，周玉梅，李妍妍

(1.鄭州市第三人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/河南省兒童醫(yī)院/鄭州兒童醫(yī)院 呼吸科一病區(qū)，河南 鄭州 450018)

近年來(lái)，艾滋病感染率有所上升，臨床防治形勢(shì)嚴(yán)峻，人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)抗體檢測(cè)顯得尤為重要。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是檢測(cè)各種抗體、抗原的常用方法，具有特異性強(qiáng)、敏感度高、可重復(fù)性等優(yōu)勢(shì)，且試劑較為穩(wěn)定，操作方便，適用于大規(guī)模篩查[1]。但ELISA檢測(cè)結(jié)果受多種因素影響，如何避免影響因素干擾以提高臨床診斷準(zhǔn)確率，是臨床研究重點(diǎn)關(guān)注方向?；诖耍狙芯刻接慐LISA法檢測(cè)HIV抗體的影響因素。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源收集鄭州市第三人民醫(yī)院2017年10月至2019年10月接受HIV抗體篩查的3 144例血液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，其中初診疑似HIV陽(yáng)性標(biāo)本11例，經(jīng)確認(rèn)HIV陽(yáng)性4例。

1.2 試劑(1)選擇：選擇特異度、敏感度較好、經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)批準(zhǔn)的試劑，若更換試劑批號(hào)則需進(jìn)行平行試驗(yàn)，嚴(yán)格在有效期內(nèi)使用。(2)預(yù)處理：檢測(cè)前將試劑盒與室溫下放置20～30 min，盡量與室溫保持一致。(3)內(nèi)部對(duì)照：進(jìn)行試劑盒所提供陰性、陽(yáng)性血清對(duì)照，內(nèi)部對(duì)照無(wú)效則需再次檢測(cè)；注意內(nèi)部對(duì)照僅限于同批號(hào)。(4)本研究所用試劑分別為：武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字S19991013；河南華美生物工程有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字S20010066。

1.3 溫度(1)于恒溫箱內(nèi)放置溫度計(jì)，避免實(shí)際溫度與恒溫箱顯示溫度存在差異。(2)預(yù)先評(píng)估不同季節(jié)微孔板從室溫拿到溫箱后孔內(nèi)溫度達(dá)到37 ℃所用時(shí)間，確保設(shè)定溫度下反應(yīng)時(shí)間充足，將溫度計(jì)置于微孔板溶液進(jìn)行觀察。(3)本研究所用溫度計(jì)均經(jīng)相關(guān)部門(mén)檢測(cè)合格。

1.4 其他因素(1)加樣操作時(shí)注意勿出現(xiàn)氣泡，勿觸及孔壁，加樣完成后混勻，覆膜。(2)反應(yīng)板浸泡時(shí)間、洗滌次數(shù)可對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響，一般每次浸泡50 s，洗滌5～6次。(3)檢測(cè)標(biāo)本吸光度前進(jìn)行酶標(biāo)儀預(yù)熱，時(shí)間>20 min，判讀時(shí)間<15 min。

1.5 檢測(cè)方法參照《全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》進(jìn)行檢測(cè)，雙波長(zhǎng)450 nm/ 630 nm，標(biāo)本值<0.1+陰性對(duì)照值均值則為陰性，≥0.1+陰性對(duì)照值均值則為陽(yáng)性，陰性對(duì)照值>0.1且陽(yáng)性對(duì)照值<0.5表明檢測(cè)失敗。連續(xù)檢測(cè)4次。

1.6 觀察指標(biāo)(1) ELISA法進(jìn)行HIV抗體篩查結(jié)果及市疾病防控中心確認(rèn)結(jié)果；(2) ELISA法檢測(cè)HIV抗體的影響因素。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)結(jié)果3 144例血液標(biāo)本經(jīng)兩種試劑盒4次檢測(cè)結(jié)果均一致，陽(yáng)性11例，陽(yáng)性率為0.35%。見(jiàn)表1。送至本市疾病防控中心確認(rèn)，陽(yáng)性4例，陽(yáng)性率為0.13%。

表1 兩種試劑盒4次檢測(cè)結(jié)果(n)

2.2 影響因素ELISA檢測(cè)HIV抗體過(guò)程中7例假陽(yáng)性影響因素分別為：1例由于血液標(biāo)本未妥善處理，受異嗜性抗體影響；3例血液標(biāo)本污染；3例血液標(biāo)本出現(xiàn)溶血。

3 討論

現(xiàn)階段，我國(guó)HIV感染者較多，但感染者對(duì)自身健康狀況并不了解，通過(guò)抗體檢測(cè)才能最終確認(rèn)。因此，提高臨床篩查準(zhǔn)確度，避免檢測(cè)過(guò)程中影響因素干擾尤為重要。本研究結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)分析HIV抗體ELISA檢測(cè)過(guò)程各個(gè)階段，以找出對(duì)檢測(cè)結(jié)果存在影響的相關(guān)因素，提出干預(yù)措施進(jìn)行預(yù)防，達(dá)到減少假陽(yáng)性、假陰性的目的。

血液標(biāo)本是臨床檢測(cè)主體，若標(biāo)本受到污染，出現(xiàn)溶血，貯存不當(dāng)及處理不當(dāng)?shù)纫子绊憴z測(cè)結(jié)果，從而出現(xiàn)假陰性、假陽(yáng)性情況。血液標(biāo)本影響因素分為內(nèi)源性干擾因素和外源性干擾因素，其中外源性主要為標(biāo)本采集、運(yùn)送、貯存過(guò)程中出現(xiàn)問(wèn)題，導(dǎo)致標(biāo)本受污染或溶血，另外貯存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、抗凝物加入同樣會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果[2]。本研究應(yīng)對(duì)措施如下：標(biāo)本采集避免溶血，采集后自然放置1～2 h，血塊收縮、血液凝固后進(jìn)行離心處理，血清立即檢測(cè)，若保存時(shí)間>7 d則保存于-20 ℃環(huán)境中；需抗凝時(shí)避免使用酶抑制劑，防止降低酶活性。內(nèi)源性干擾因素主要指類(lèi)風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、異嗜性抗體、非特異性免疫球蛋白等[3]。本研究應(yīng)對(duì)措施如下：給予 pH=7.2的0.01 mol·L-1磷酸鹽進(jìn)行稀釋?zhuān)壤秊?∶1，進(jìn)行血清滅活30 min，溫度56 ℃。

試劑選擇需經(jīng)注冊(cè)批準(zhǔn)且檢驗(yàn)合格，經(jīng)臨床評(píng)估結(jié)果、鑒定報(bào)告等對(duì)比后選擇特異度、靈敏度較高的試劑盒，注意在有效期；檢測(cè)前的預(yù)處理十分重要，但基層檢驗(yàn)人員易忽略。本研究則在檢測(cè)前將其取出置于室溫下放置20～30 min，保證使用前與室溫盡量一致，避免由于溫度原因影響抗體抗原反應(yīng)速度，進(jìn)而影響檢測(cè)結(jié)果；對(duì)同批號(hào)試劑盒進(jìn)行內(nèi)部對(duì)照，確保試驗(yàn)有效性。

標(biāo)本質(zhì)量對(duì)臨床檢測(cè)過(guò)程極為重要，血清是臨床最常用標(biāo)本，血清分離時(shí)必須完全徹底分離，避免出現(xiàn)纖維蛋白伴血清標(biāo)本加入反應(yīng)孔而在孔底吸附，造成假陽(yáng)性。血清標(biāo)本需冷凍保存，注意保存時(shí)勿反復(fù)凍融，其原因在于標(biāo)本反復(fù)凍融會(huì)產(chǎn)生機(jī)械剪切力，破壞蛋白分子，導(dǎo)致假陰性[4]。另外，溶血標(biāo)本所出現(xiàn)的游離血紅蛋白具有過(guò)氧化物酶作用，可通過(guò)催化辣根過(guò)氧化物酶底物顯色造成假陽(yáng)性[5-6]。但臨床實(shí)際操作時(shí)、試驗(yàn)前均會(huì)進(jìn)行2次洗板，將參與的游離血紅蛋白清除，使其對(duì)臨床檢測(cè)幾乎無(wú)影響。

儀器及操作人員技術(shù)對(duì)臨床檢測(cè)結(jié)果有一定的影響，HIV抗體檢測(cè)需嚴(yán)格遵守《全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》流程。操作人員須嚴(yán)格消毒，穿戴工作衣、手套，按照說(shuō)明書(shū)規(guī)范使用移液器，加樣時(shí)孔內(nèi)按照規(guī)定量添加，勿在邊緣位置加樣，注意吸頭勿碰到抗原，快放慢吸，避免濺出、出現(xiàn)氣泡；加樣完成更換吸頭，避免交叉感染；滴加試劑前搖勻，并將第1滴擠去，避免出現(xiàn)氣泡；移液器需定期校正。ELISA判斷結(jié)果為酶催化底物顯色，而酶催化底物、抗體抗原結(jié)合效率均與溫度密切相關(guān)：溫度過(guò)高則顯色較深，溫度較低則顯色較淺，對(duì)臨床檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性有明顯影響[7-8]。溫度對(duì)ELISA檢測(cè)成功與否十分關(guān)鍵[9-10]。ELISA檢測(cè)時(shí)控制溫度后需調(diào)控恒溫箱，在明確恒溫箱面板溫度的同時(shí)，在箱內(nèi)放置溫度計(jì)，避免溫差影響檢測(cè)結(jié)果；抗體最合適反應(yīng)溫度為37 ℃，保證抗體抗原充足的反應(yīng)時(shí)間。另外，洗板對(duì)ELISA檢測(cè)非常關(guān)鍵，參照說(shuō)明書(shū)設(shè)置洗滌次數(shù)、浸泡時(shí)間，完成后還應(yīng)以蒸餾水進(jìn)行沖洗，避免堵塞；注意試劑盒洗滌劑勿混合使用，使用不同酶標(biāo)板時(shí)調(diào)整吸液頭，避免卡住，及時(shí)更換破損吸液頭。

綜上，ELISA法檢測(cè)HIV抗體影響因素涉及標(biāo)本、采集、試劑選擇和處理、溫度調(diào)控、操作人員技術(shù)等各個(gè)方面。通過(guò)對(duì)標(biāo)本、試劑、溫度及操作流程進(jìn)行干預(yù)，可有效避免假陽(yáng)性、假陰性出現(xiàn)。臨床應(yīng)消除影響因素干擾，提高檢測(cè)準(zhǔn)確率，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。