劉澤文，袁芳艷，劉 威，高 婷，周丹娜，楊克禮，段正贏，郭 銳，梁 婉，田永祥

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所∕農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064）

從湖北省某有肺炎癥狀死亡的肥育豬中分離出一種呈兩極著色、革蘭氏染色陰性的短小桿菌，經(jīng)PCR 和生化鑒定確定為豬溶血性曼氏桿菌（Mannheimia haemolytica）?，F(xiàn)將試驗(yàn)情況報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

TSA 和TSB 培養(yǎng)基，按說(shuō)明書(shū)配制，滅菌后加入5%的小牛血清。

1.2 病料采集與培養(yǎng)

采集發(fā)病豬肺臟，接種含5% 血清的TSA 平板，37 ℃培養(yǎng)20～24 h，挑選單個(gè)帶藍(lán)光菌落，再接種5% 血清的TSA 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)20～24 h 后進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

1.3 細(xì)菌的鑒定

1.3.1 鏡檢 挑選TSA 培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落，經(jīng)革蘭氏染色，顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.3.2 PCR 鑒定 用細(xì)菌通用引物16s 進(jìn)行鑒定，參照文獻(xiàn)［1］合成PCR 引物：上游引物sgF：5’-AG AGTTTGATCATGGCTCAG-3’；下游引物sgR：5’-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’，擴(kuò)增片段大小1 500 bp 左右。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.3.3 生化試驗(yàn) 挑選TSA 上單個(gè)菌落接種改良TSB 培養(yǎng)基，37 ℃振搖培養(yǎng)16～20 h 后分別接種糖發(fā)酵和其他生化試驗(yàn)培養(yǎng)基小管，37 ℃培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

1.4 藥敏試驗(yàn)

將分離純化的菌株按常規(guī)方法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)［2］。

1.5 致病性試驗(yàn)

將分離菌株接種TSB 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18 h后用于小白鼠攻毒進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，然后進(jìn)行濃縮后稀釋成5×107、1×108、2×108、3×108CFU∕mL 劑量組對(duì)小白鼠進(jìn)行攻毒，每組8 只小白鼠，每只腹腔注射0.5 mL，觀察小白鼠的死亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)、染色特性

分離菌株在TSA 瓊脂平板上形成圓形、光滑、濕潤(rùn)、半透明小菌落（圖1）。革蘭氏染色呈兩極著色、短小的陰性桿菌（圖2）。

圖1 分離菌株菌落形態(tài)

圖2 分離菌株革蘭氏染色

2.2 PCR 鑒定結(jié)果

分離菌株用16s 通用引物擴(kuò)增出1 500 bp 左右目的條帶（圖3），送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)GenBank 進(jìn)行序列比對(duì)，該分離菌株與溶血性曼氏桿菌基因序列同源率在99.7%以上。

圖3 分離菌株通用引物PCR 擴(kuò)增

2.3 生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果

由表1 可以看出，該分離菌株的生化特性符合溶血性曼氏桿菌的生物學(xué)特性。

表1 分離菌株的生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表2 可以看出，該菌株除對(duì)阿米卡星和林可霉素耐藥，卡那霉素中度敏感以外，對(duì)頭孢呋辛、頭孢曲松、氨芐西林、環(huán)丙沙星等均高度敏感。

表2 分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.5 致病性試驗(yàn)結(jié)果

用不同劑量的分離菌株對(duì)小白鼠進(jìn)行攻毒后，小白鼠均出現(xiàn)精神沉郁、被毛逆立、呼吸急促等臨床癥狀，2×108CFU∕mL 以上劑量組小白鼠均在24 h 以?xún)?nèi)死亡；剖檢病死亡小白鼠可見(jiàn)肺臟充血、出血，并從病死小白鼠肺臟中分離到接種菌株，表明該分離株對(duì)小白鼠具有較強(qiáng)的致病性。

表3 分離菌株致病性試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

通過(guò)細(xì)菌分離、革蘭氏染色、通用引物PCR 擴(kuò)增和序列比對(duì)和生化試驗(yàn)鑒定，確定該分離菌株為溶血性曼氏桿菌。

溶血性曼氏桿菌病是牛、羊等反芻動(dòng)物的重要呼吸道傳染?。?］，溶血性曼氏桿菌是該病的病原，屬于曼氏桿菌屬。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)其的報(bào)道很多［4，5］，能夠引起牛、綿羊的肺炎，新生羔羊的急性敗血癥，給養(yǎng)牛業(yè)、養(yǎng)羊業(yè)帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)報(bào)道全球30% 的病死牛與其有關(guān)，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失［6］。而對(duì)于豬溶血性曼氏桿菌的報(bào)道很少，此次病原分離鑒定結(jié)果表明，該菌也可在豬的呼吸道中寄生。致病性試驗(yàn)結(jié)果表明，該分離菌株可以致死昆明小鼠，具有較強(qiáng)毒力，與馬增軍等［7］報(bào)道的對(duì)小白鼠無(wú)致病力差別較大，但其是否對(duì)豬致病，還有待進(jìn)一步研究。

分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株對(duì)阿米卡星和林可霉素耐藥、對(duì)卡那霉素中敏以外，對(duì)其余的13 種抗生素全部高敏，高敏紙片占全部藥敏紙片的81.3%（13∕16），與李雪霞等［8］報(bào)道的85.7%（12∕14）一致，表明藥物治療對(duì)曼氏桿菌感染效果良好。