喬 木，李康馳，吳俊靜，武華玉，周佳偉，梅書棋，彭先文

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所∕動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，武漢 430064）

產(chǎn)仔數(shù)性狀是影響豬繁殖性能的重要經(jīng)濟(jì)性狀之一，對養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益有著直接的影響。影響豬產(chǎn)仔數(shù)的因素有很多，如遺傳、環(huán)境以及品種等，遺傳是主要的影響因素。而豬產(chǎn)仔數(shù)性狀受多基因控制，并且其遺傳力較低，依靠傳統(tǒng)的育種方法周期長，進(jìn)展緩慢。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將分子標(biāo)記輔助選擇育種與傳統(tǒng)育種相結(jié)合，可以有效加快豬繁殖性狀的選擇進(jìn)程。因此，尋找影響母豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的候選基因及關(guān)鍵分子遺傳標(biāo)記，并將其用于標(biāo)記輔助選擇育種，對提高母豬的繁殖性能具有重要意義。

氧化型低密度脂蛋白受體1 基因（Oxidized low-density lipoprotein receptor1，OLR1）具有結(jié)合和氧化低密度脂蛋白的作用［1］，有關(guān)該基因的研究主要集中于人類心腦血管系統(tǒng)的疾病［2-4］，在小鼠中主要影響甘油三酯的形成和脂肪細(xì)胞的分化［5-7］，在牛中有研究表明與牛乳脂率和牛肉品質(zhì)相關(guān)，該基因在豬脂肪組織高表達(dá)并且與胴體和脂肪形狀相關(guān)［8，9］，但是未見與母豬產(chǎn)仔數(shù)性狀相關(guān)的報道。

本研究篩選鑒定了豬OLR1基因遺傳多態(tài)位點，并在硒都黑豬中進(jìn)行了基因型分布檢測，將不同基因型與產(chǎn)仔數(shù)性狀進(jìn)行了相關(guān)性分析，為豬的繁殖性狀標(biāo)記輔助選擇育種提供新的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采集355 頭硒都黑豬血樣（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所原種豬場），并收集其總產(chǎn)仔數(shù)（Total number born，TNB）和產(chǎn)活仔數(shù)（Number born alive，NBA）性狀記錄。

1.2 PCR 擴(kuò)增、測序及SNP 篩選

采用Invitrogen 公司的DNA 提取試劑盒（PureLinkTMPro 96 Genomic DNA Purification Kit，K182104A）提取基因組DNA，按照說明書進(jìn)行操作。

根據(jù)NCBI 中豬OLR1基因序列（GenBank 登錄號：NC_010447.5），采用primer 5 設(shè)計引物。上游引物：5"-AGCCGGGAGAACTGCTTG-3"，下游引物：5"-AGACCCACCATACCCTGT-3"，由北京奧科生物科技有限公司合成。

PCR 總反應(yīng)體系（20 μL）：基因組DNA 1 μL，2×TaqPCR Mix 10 μL，上、下游引物（10 μmol∕L）各1 μL，滅菌ddH2O 7 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸20 s，34 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物以1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目的條帶利用生工生物工程（上海）有限公司的Gel Extraction Kit 試劑盒進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物送至北京奧科生物技術(shù)有限公司測序，序列比對篩選SNP。

1.3 多態(tài)性分布規(guī)律檢測

采用PCR 直接測序法在355 頭硒都黑豬群體中進(jìn)行SNP 不同基因型的分布規(guī)律檢測。

1.4 統(tǒng)計分析

用SAS 9.1 統(tǒng)計軟件GLM 程序分析此多態(tài)位點的不同基因型與硒都黑豬總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)性狀的相關(guān)性。進(jìn)行不同SNP 基因型組合的方差分析，并進(jìn)行顯著性檢驗，所采用模型為：

式中，Yij為性狀表型值，μ為平均值，Gi為基因型效應(yīng)（包括基因加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)；加性效應(yīng)用1、0 和-1 分別代表TT、TC 和CC 基因型，顯性效應(yīng)用1、-1 和1 分別代表TT、TC 和CC 基因型）；Fj為豬場綜合效應(yīng)；eij為殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬OLR1 基因多態(tài)性檢測結(jié)果

選取10 頭硒都黑豬基因組DNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得片段長度238 bp（圖1）。

圖1 豬OLR1 基因部分序列PCR 產(chǎn)物

測序發(fā)現(xiàn)在此段序列的第70 bp 處存在T∕C 突變，與NCBI 中豬的基因組序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)位于基因組g.61808176 bp 處，存在TT、TC 和CC 3 種基因型（圖2）。

圖2 豬OLR1 基因g.61808176 處T/C 突變位點測序

2.2 豬OLR1 基因SNP 位點在硒都黑豬群體中的分布規(guī)律

在硒都黑豬群體中檢測OLR1基因g.61808176 T∕C 位點等位基因頻率和基因型分布規(guī)律如表1 所示。從表1 可以看出，存在TT、TC 和CC 3 種基因型，TT 基因型個體最多，T 等位基因占95.9%。

表1 OLR1 基因g.61808176 T/C 位點多態(tài)性分布規(guī)律

2.3 性狀關(guān)聯(lián)分析

在355 頭硒都黑豬群體中進(jìn)行不同基因型與總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)性狀間的關(guān)聯(lián)分析，統(tǒng)計分析結(jié)果如表2 所示。由表2 可以看出，在硒都黑豬中，g.61808176 T∕C 位點的TT 基因型個體的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)都極顯著高于TC 和CC 基因型個體（P<0.01），且加性效應(yīng)達(dá)到極顯著水平（P<0.01），因此T 等位基因是優(yōu)勢等位基因。

表2 豬OLR1 基因g.61808176 T/C 突變位點與繁殖性狀關(guān)聯(lián)分析

3 小結(jié)與討論

目前已報道的豬產(chǎn)仔數(shù)性狀相關(guān)基因有ESR、FSHβ、RBP4和PRLR等［10-12］；豬產(chǎn)仔數(shù)性狀相關(guān)的SNPs 如OPN基因第6 136 bp 處C∕A 突變［13］，BM?PR1B基因第6 外顯子595 bp 處的G∕C 和643 bp處的C∕T 突變等。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多與產(chǎn)仔數(shù)性狀相關(guān)的基因被發(fā)現(xiàn)［14］，但主效基因以及主效基因相關(guān)SNPs 研究較少［15］。

本研究鑒定獲得了豬OLR1基因g.61808176 處T∕C 突變位點，位于OLR1基因第四內(nèi)含子的7 bp，在355 頭硒都黑豬中對不同基因型分布規(guī)律進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)T 等位基因占比最高。首次將不同基因型與產(chǎn)仔性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，TT 基因型個體的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)最高，其次為TC 基因型個體，CC基因型個體總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)都顯著低于TT 型個體，T 等位基因為提高豬產(chǎn)仔性能有利等位基因，在育種中選留TT 基因型和TC 基因型個體，有利于提高豬的繁殖性能，該分子標(biāo)記可用于豬繁殖性狀標(biāo)記輔助選擇。