王佐乾，潘竹青，張 舒，游景茂，王友平，楊小林

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所∕農(nóng)作物重大病蟲草害防控湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∕農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華中作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所，湖北 恩施 445000）

黃連（Coptis chinensisFranch.）是中國傳統(tǒng)中藥材之一，其干燥根莖入藥具有清熱解毒的功效［1］。目前，黃連種植適宜海拔高度為1 200～1 800 m，人工栽培主要分布在湖北省西部、四川省東部和云南省西部，其中湖北省恩施市和重慶市石柱縣是主要產(chǎn)區(qū)［2］。因黃連種植需5～6年，在長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)栽培中易因病害累積造成較大產(chǎn)量損失。已報(bào)道的黃連病害有葉斑病、白絹病、白粉病和紫紋羽病等［3-5］。病害發(fā)生若得不到有效控制會(huì)造成大面積減產(chǎn)甚至絕收。

重慶市石柱縣首次報(bào)道一種新的葉部病害，調(diào)查結(jié)果顯示種植區(qū)存在普遍發(fā)生，發(fā)生率為10%～100%，造成產(chǎn)量損失可達(dá)30%。其典型癥狀為水漬狀病斑，在灰色中心具有黑色孢子堆。通過形態(tài)學(xué)觀察和系統(tǒng)發(fā)育分析，確定致病菌為Colletotrichum boninense［6］。本研究在恩施市板橋鎮(zhèn)采集了一種新的葉部病害，該病害主要侵染葉片，其病害特征與炭疽病相似。為了鑒定病原菌，采集具有典型病征的葉片，通過組織分離法得到病原菌，通過形態(tài)學(xué)觀察和ITS 序列系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，通過離體葉片接種確定了其致病性，進(jìn)一步對(duì)致病菌適宜生長(zhǎng)培養(yǎng)基、光照條件和主流殺菌劑抑制率進(jìn)行了測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)菌株：菌株采集于湖北省恩施市板橋鎮(zhèn)。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato dex?trose agar，PDA）：無菌水1 000 mL、馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g；馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato sucrose agar，PSA）：無菌水1 000 mL、馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g；燕麥瓊脂培養(yǎng)基（Oatmeal agar，OA）：無菌水1 000 mL、燕麥20 g、瓊脂20 g；綠豆瓊脂培養(yǎng)基（Mung bean agar，MA）：無菌水1 000 mL，綠豆80 g、瓊脂20 g、磷酸二氫鉀1 g；玉米瓊脂培養(yǎng)基（Cornmal agar，CA）：無菌水1 000 mL、玉米粉60 g、瓊脂20 g。

供試藥劑：15% 三唑酮可濕性粉劑（四川潤爾科技有限公司），70% 甲基硫菌靈可濕性粉劑（江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司），10% 苯醚甲環(huán)唑微乳劑（山東東泰農(nóng)化有限公司），25% 吡唑醚菌酯懸浮劑［巴斯夫植物保護(hù)（江蘇）有限公司］，43% 戊唑醇懸浮劑［拜耳作物科學(xué)（中國）有限公司］。

試劑及儀器：PCR 酶預(yù)混液（Taq PCR Master?Mix）、凝膠電泳DNA marker（Trans 2K Plus）均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。SW-CJ-2FD 超凈實(shí)驗(yàn)工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），Gel DocTM Imager 凝膠成像系統(tǒng)、S1000TM Thermal cy?cler PCR 儀（美國Bio-RAD 公司），DYY-6C 水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司），GXZ 智能光照培養(yǎng)箱（寧波東南儀器有限公司），Centrifuge 5424高速離心機(jī)（德國Eppendorf 公司），PB-10 pH 酸度計(jì)（德國Sartorius 公司），恒溫?fù)u床（武漢華美生物工程有限公司），BK1201 型光學(xué)顯微鏡（重慶重光實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離及致病性測(cè)定 使用無菌水清洗病葉，從病健交界處剪4 mm2組織，75% 乙醇溶液消毒30 s，0.1% 升汞液表面消毒1 min，無菌水沖洗2～3 次，用消毒的鑷子夾取剪好的材料，放入PDA 培養(yǎng)基平板上。每皿均勻排放4～5 塊，25 ℃下培養(yǎng)5 d，將獲得的菌株通過單孢純化保存在PDA 平板上。

從黃連植株上選取大小一致健康無病害的葉片，用75% 乙醇溶液表面消毒1 min，從培養(yǎng)皿中取直徑6 mm 的圓形菌絲塊，接種到健康黃連葉片上，每個(gè)菌株接種3 片葉片，以PDA 培養(yǎng)基瓊脂塊為對(duì)照。置于搪瓷盤內(nèi)于25 ℃保濕培養(yǎng)，接種3 d 后移去菌絲塊，觀察發(fā)病情況。

1.2.2 病原菌鑒定

1）病原菌形態(tài)學(xué)鑒定。將分離所得病原菌分別接種到PDA 平板上，25 ℃暗培養(yǎng)，5 d 后觀察菌落的形態(tài)、顏色、大小、分生孢子及產(chǎn)孢特征等。

2）病原菌的分子鑒定。采用CTAB 法提取菌株基因組DNA［7］，并使用通用引物ITS1∕4 對(duì)病原菌的目的基因序列進(jìn)行擴(kuò)增［8］。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系：TaqPCR MasterMix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、ITS1 1 μL、ITS4 1 μL、模板DNA 1 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。

PCR 擴(kuò)增樣品的純化、測(cè)序均委托武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行，測(cè)序結(jié)果核苷酸序列提交BLAST（https：∕∕blast.ncbi.nlm.nih.gov∕Blast.cgi）序列初步分析比對(duì)。使用MEGA 7.0 采用鄰接法（Neighbor-jointing）與已知炭疽菌對(duì)照序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定菌株到復(fù)合群。

1.2.3 病原菌生物學(xué)特性測(cè)定

1）病原菌在不同光照條件下的生長(zhǎng)情況。用打孔器打取直徑6 mm 的菌絲塊接種到PDA 平板上，將平板分別放在連續(xù)光照、連續(xù)黑暗、12 h 光暗交替的培養(yǎng)箱中25 ℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d 后用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，每個(gè)處理4 個(gè)重復(fù)。

2）病原菌在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。用打孔器打取直徑6 mm 的菌絲塊分別接種到PDA 培養(yǎng)基、PSA 培養(yǎng)基、燕麥瓊脂培養(yǎng)基、綠豆瓊脂培養(yǎng)基和玉米瓊脂培養(yǎng)基上，將平板放置在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌絲生長(zhǎng)情況，3、5、7 d 后分別用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，每個(gè)處理4 個(gè)重復(fù)。

1.2.4 殺菌劑對(duì)病原菌的毒力測(cè)定 使用菌絲生長(zhǎng)速率法對(duì)5 種供試藥劑炭疽菌抑制中濃度進(jìn)行測(cè)定。每種藥劑分別設(shè)定5 個(gè)濃度梯度，其中吡唑醚菌酯濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 μg∕mL，苯醚甲環(huán)唑濃度為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μg∕mL，甲基硫菌靈的濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、5.0 μg∕mL，三唑酮濃度為5.0、10.0、50.0、100.0、200.0 μg∕mL，戊唑醇濃度為1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg∕mL。將上述5 種殺菌劑按照相應(yīng)濃度配制母液，根據(jù)各濃度梯度將母液按一定體積加入溶化的PDA 培養(yǎng)基并混勻，制成含有不同濃度殺菌劑的PDA 平板，每個(gè)處理重復(fù)5 次，以不含藥平板為對(duì)照。打取直徑6 mm 的菌絲塊接種到待測(cè)平板上，放置在25 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d 后用十字交叉法測(cè)定各處理平板的菌落直徑，計(jì)算各處理的相對(duì)抑制率，相對(duì)抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）∕對(duì)照菌落直徑×100%。取藥劑濃度的對(duì)數(shù)值為x，菌絲生長(zhǎng)相對(duì)抑制率的概率值為y，求得毒力回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃連炭疽病的病原菌分離及致病性分析

將采集到的黃連病葉組織分離，分離得到菌株中炭疽菌的占比達(dá)到了80%，除炭疽菌和莖點(diǎn)菌（Phomaspp.）較多，其他已報(bào)道病原菌包括赤霉菌（Gibberella avenacea），還分離出少量的黃瓜織球殼菌（Plectosphaerella cucumerina）與 擬 盤 多 毛 孢（Pestalotiopsissp.）。將分離出來所有的真菌接種到離體葉片，只有炭疽菌代表菌株EsH2、EsH6 接種時(shí)能夠完成侵染，并形成與病葉相同的病斑。

接種葉片在25 ℃下保濕培養(yǎng)48 h，菌株EsH2、EsH6 菌絲塊所接種的葉片最初產(chǎn)生黑褐色斑點(diǎn)狀病斑，隨發(fā)病時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸擴(kuò)展并發(fā)展為輪紋狀水漬斑，病斑平均增長(zhǎng)率為3.15 mm∕d，接種6 d 后病株侵染了整個(gè)葉片（圖1）。

圖1 炭疽菌菌落形態(tài)和離體葉片接種

2.2 菌株的形態(tài)學(xué)觀察與分子鑒定

菌株在PDA 培養(yǎng)基上菌落均為圓形，淺橙色，邊緣規(guī)則，表面少量絨狀氣生菌絲，生長(zhǎng)速度較快。病原菌菌絲有隔，菌絲發(fā)育后期頂端形成分生孢子，EsH2 和EsH6 分生孢子呈橢圓形，有分隔，大小分別為（17.3±4.9）μm×（5.6±0.8）μm 和（15.0±2.9）μm×（4.8±0.6）μm，顯微光學(xué)觀察與Colletotrichum boni?nense模式菌株及分生孢子典型特征比較分析，結(jié)果表明基本一致［9］。采用通用引物ITS1∕4 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過產(chǎn)物回收測(cè)序，獲得菌株ITS 鑒定序列。經(jīng)過BLAST 比對(duì)，初步確定致病菌為炭疽菌（Collet?otrichumspp.）。與120 個(gè)鑒定菌株的ITS 序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明，EsH2 和EsH6 同屬于Colletotrichum boninense復(fù)合種，與重慶市石柱縣報(bào)道一致。

圖2 基于ITS 序列采用NJ 法構(gòu)建菌株EsH2 和EsH6與相關(guān)菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)菌株EsH2、EsH6 菌絲生長(zhǎng)的影響

菌株EsH2 培養(yǎng)3 d 后在PDA、PSA、燕麥、玉米、綠豆培養(yǎng)基上平均菌落直徑為33.0、33.0、31.2、30.7、33.0 mm。培養(yǎng)5 d 后在PDA、PSA、燕麥、玉米、綠豆培養(yǎng)基上平均菌落直徑為54.1、52.7、51.4、51.2、54.2 mm。培養(yǎng)7 d 后在PDA、PSA、燕麥、玉米、綠豆培養(yǎng)基上平均菌落直徑為71.2、67.5、67.5、69.4、71.8 mm。EsH2 平均生長(zhǎng)速度為：綠豆>PDA>玉米>燕麥>PSA，在綠豆瓊脂培養(yǎng)基和PDA 上生長(zhǎng)速度顯著高于其他培養(yǎng)基（表1）。

菌株EsH6 培養(yǎng)3 d 后在PDA、PSA、燕麥、玉米、綠豆培養(yǎng)基上平均菌落直徑為37.2、36.9、31.2、31.4、33.3 mm。培養(yǎng)5 d 后在PDA、PSA、燕麥、玉米、綠豆培養(yǎng)基上平均菌落直徑為62.2、62.3、57.7、55.7、57.0 mm。7 d 后在PDA、PSA、燕麥、玉米、綠豆培養(yǎng)基上平均菌落直徑為79.1、78.2、74.9、72.7、74.5 mm。EsH6 平均生長(zhǎng)速度為：PDA>PSA>燕麥>綠豆>玉米，在PDA 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度顯著高于其他培養(yǎng)基（表1）。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)黃連炭疽菌絲生長(zhǎng)速度的影響

2.4 光照對(duì)菌株EsH2、EsH6 菌絲生長(zhǎng)的影響

菌株EsH2 在連續(xù)光照、連續(xù)黑暗、12 h 光暗交替條件下培養(yǎng)5 d，菌落平均直徑為52.6、50.9、53.2 mm。菌株EsH6 在連續(xù)光照、連續(xù)黑暗、12 h 光暗交替條件下培養(yǎng)5 d，菌落平均直徑為67.5、60.8、67.2 mm。由圖3 可以看出，菌株EsH2、EsH6 連續(xù)黑暗條件下生長(zhǎng)速度均顯著低于有光照的情況，連續(xù)光照與光照黑暗交替處理之間均沒有顯著差異，說明光照對(duì)菌株生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。

圖3 不同光照條件對(duì)黃連炭疽菌絲生長(zhǎng)的影響

2.5 殺菌劑對(duì)菌株EsH2、EsH6 的抑制率

為探索田間有效防控藥劑，對(duì)市售幾種殺菌劑抑菌效率進(jìn)行測(cè)定。毒力測(cè)定結(jié)果表明，5 種藥劑對(duì)供試菌株的生長(zhǎng)都有一定的抑制作用，毒力回歸方程都達(dá)到了顯著水平。其中，苯醚甲環(huán)唑、甲基硫菌靈和吡唑醚菌酯對(duì)兩個(gè)菌株均表現(xiàn)較好的抑制效果，EC50較低，抑制相關(guān)系數(shù)較高，可用于黃連炭疽病的防治（表2）。

表2 不同殺菌劑對(duì)黃連炭疽病的毒力測(cè)定

3 討論

炭疽病菌寄主范圍廣泛，能夠侵染大豆、茶葉等經(jīng)濟(jì)作物、羽衣甘藍(lán)等蔬菜、桃梨等果樹，生產(chǎn)中造成的經(jīng)濟(jì)損失極大［10-13］。炭疽菌種類多樣，形態(tài)、致病力存在部分差異，經(jīng)調(diào)查中國侵染梨樹病害的多達(dá)百種，菌株分屬于10 個(gè)復(fù)合群［14］。黃連炭疽病研究仍然較少，僅有報(bào)道在重慶市石柱縣發(fā)現(xiàn)該病，經(jīng)鑒定為博寧炭疽菌（C.boninense）［6］。本研究首次在湖北省恩施市板橋鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)黃連炭疽病，經(jīng)柯赫氏法則確定分離菌株為致病菌，通過鑒定明確致病菌株同為博寧炭疽菌。

不同炭疽菌培養(yǎng)條件存在差異，適宜的培養(yǎng)條件是致病菌研究的基礎(chǔ)。馬鈴薯炭疽菌在PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快［15］。菜心炭疽病致病菌希金斯刺盤孢（Colletotrichum higginsianum）在菜心榨汁和PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快［16］。柑橘膠孢炭疽菌（Col?letotrichum gloeosporioides）經(jīng)檢測(cè)在橘汁培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快［17］。此次研究中生長(zhǎng)速度數(shù)據(jù)表明，黃連炭疽病致病菌博寧炭疽菌在PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度較快，該結(jié)果與部分炭疽菌相似。博寧炭疽菌在光照條件下生長(zhǎng)較快，與其他炭疽菌一致［18］。

炭疽菌存在較多復(fù)合群和亞種，針對(duì)不同的炭疽菌需篩選特異性高效殺菌劑。柑橘炭疽病是由膠孢炭疽菌引起的真菌病害，毒力試驗(yàn)結(jié)果表明，嘧菌酯、咪鮮胺、丙森鋅和唑醚·代森聯(lián)防治效果較好［19］。生產(chǎn)中草莓膠孢炭疽菌采用苯并咪唑類、甲氧基丙烯酸酯（QoIs）類和甾醇脫甲基抑制劑類（DMIs）殺菌劑作為主要防治藥劑，田間菌株普遍對(duì)甲基硫菌靈具有較高抗藥性［20］。經(jīng)21 種殺菌劑毒力測(cè)定，50% 咪鮮胺對(duì)梨樹膠孢炭疽菌毒力最強(qiáng)［21］。但對(duì)博寧炭疽菌殺菌劑毒力測(cè)定報(bào)道較少，僅在大葉桉博寧炭疽菌毒力測(cè)定結(jié)果中顯示，70%代森錳鋅和80% 炭疽福美防治效果較好［22］。此次對(duì)博寧炭疽菌毒力測(cè)定結(jié)果提出苯醚甲環(huán)唑、甲基硫菌靈和吡唑醚菌酯是有效的防治藥劑，為黃連炭疽病防控提供了新的藥劑選擇。

黃連栽培過程中存在嚴(yán)重的連作障礙問題，如不休地或輪作其他作物，將會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的病害問題［23］。除存在黃連根腐病和白絹病等較嚴(yán)重根部病害，葉部病害的再侵染也會(huì)導(dǎo)致病害發(fā)生的積累［4］。本研究首次報(bào)道了湖北省黃連炭疽病的發(fā)生，明確了博寧炭疽菌是其致病菌，并分析了生物學(xué)特性及多種藥劑的敏感性，對(duì)黃連炭疽病的防治提供了可靠的理論依據(jù)。