吳兆圓，張志剛，張亞妮，劉 芳，方 偉

（湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢 430064）

利用自然界生物中具有生物活性的代謝產(chǎn)物開(kāi)發(fā)新的生物源除草劑是生物除草劑研發(fā)的一個(gè)重要途徑和未來(lái)發(fā)展方向。這類(lèi)化合物具有化學(xué)結(jié)構(gòu)新異，作用靶點(diǎn)獨(dú)特，廣譜、低毒、低殘留、受環(huán)境影響較小等特點(diǎn)，而源于真菌的活性產(chǎn)物最多，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了7 萬(wàn)多種［1］。如從多節(jié)孢屬真菌Nodulispori?umsp. A21 中得到的化合物Deoxysporothric acid 和Epideoxysporothric acid，50～200 μg∕mL 時(shí)能顯著抑制雙子葉雜草鱧腸（Eclipta prostrata）和阿拉伯婆婆納（Veronica persica）的生長(zhǎng)［2］。旋孢腔菌屬真菌Co?chliobolus australiensis是從雜草水牛草（Cenchrus cil?iaris）中分離得到的病原真菌，其產(chǎn)生的次生代謝物Cochliotoxin 相對(duì)于原生草，選擇性地對(duì)水牛草產(chǎn)生植物毒性，可以作為水牛草的天然除草劑［3］。由鐮刀菌屬真菌FusariumDA056446 和炭豆菌屬真菌RoselliniaDA092917 產(chǎn)生的次生代謝物Mevalocid?in，除草譜廣，苗后除草作用大于苗前，而且除草作用起效慢，雜草呈現(xiàn)的狀態(tài)與已知的商用除草劑處理后的狀態(tài)均不同，很可能為新的除草機(jī)制，并且能在韌皮部移動(dòng)，具有開(kāi)發(fā)前景［4］。由鏈格孢屬真菌Alternaria alternata產(chǎn)生的細(xì)交鏈格孢菌酮酸（Tenu?azonic acid，TeA）也是廣譜除草劑，且是入侵雜草紫莖澤蘭（Ageratina adenophora）褐斑病的主要致病因子。研究表明，TeA 是一種天然的光系統(tǒng)II 抑制劑，并且田間試驗(yàn)表明有機(jī)合成的TeA 能有效控制棉花田的2 種重要雜草馬唐（Digitaria sanguinalis）和反枝莧（Amaranthus retroflexus），但對(duì)棉花無(wú)影響［5］。這些化學(xué)結(jié)構(gòu)豐富和生物活性多樣性的真菌次生代謝產(chǎn)物為開(kāi)發(fā)新的除草劑提供了絕佳的機(jī)會(huì)。

本研究在微生物源農(nóng)藥活性代謝產(chǎn)物的篩選過(guò)程中，得到1 株具除草活性的真菌NBERC_51984，經(jīng)過(guò)活性追蹤、大量發(fā)酵、提取、從活性部位分離純化得到了2 個(gè)化合物（圖1），經(jīng)LC-MS 和1D、2DNMR 鑒定為Pseurotin A（1）和Bisdethiobis（methyl?thio）gliotoxin（2），并對(duì)其除草活性進(jìn)行了進(jìn)一步測(cè)試。

1 材料與方法

1.1 儀器和主要試劑

Bruker AVANCE（500 MHz）核磁共振儀（TMS為內(nèi)標(biāo)，δ 為10-6，J 為Hz）、Bruker APEX DUO 單晶衍射儀（銅靶衍射）（德國(guó)Bruker BioSpin 公司）；Wa?ters 2695 液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)Waters 公司）；Waters 2767 高效液相制備儀（Waters 2525 泵，帶2767 自動(dòng)收集系統(tǒng)，2996 二級(jí)管陣列檢測(cè)器，色譜工作站Masslynx V4.0）；美國(guó)Sunfire C18OBD 制備柱（5 μm，19 mm×250 mm∕10 mm×250 mm）；100～200 目柱色譜填料柱層析硅膠（青島海洋化工廠）。分離提取用試劑乙酸乙酯和乙腈均為國(guó)藥集團(tuán)生產(chǎn)。

1.2 微生物

菌株分離于吉林省長(zhǎng)白山巖石火山土（2016年9月采樣），現(xiàn)菌種保存在湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，編號(hào)NBERC_51984。

1.3 菌株的培養(yǎng)和提取

NBERC_51984 發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽糖6.25 g∕L，麥芽 提 取 物6.25 g∕L，酵 母 提 取 物1.0 g∕L，蛋 白 胨0.625 g∕L，磷酸二氫鉀1.25 g∕L，硫酸鎂0.625 g∕L，pH 調(diào)至7.0，加入0.3%瓊脂，于28 ℃靜置培養(yǎng)7 d。

初篩時(shí)發(fā)酵液50 mL，冷凍干燥后，加入等量乙酸乙酯提取，離心，取上層有機(jī)相，回收乙酸乙酯后加入1 mL 甲醇溶解，作為活性跟蹤半制備樣品。大量發(fā)酵5 L 的發(fā)酵液中加入5 L 的乙酸乙酯攪拌提取3 次，提取液過(guò)濾后真空濃縮得到提取物0.75 g。

1.4 活性跟蹤和分離純化

活性跟蹤取800 μL 初篩樣品進(jìn)行半制備（Sun?fire C18OBD 半制備柱，5 μm，10 mm×250 mm，7.5 mL∕min），洗脫梯度為5%～100% 乙腈，洗脫40 min，得到36 個(gè)組分，溶劑蒸發(fā)后作為活性測(cè)試樣品。

大量發(fā)酵的乙酸乙酯提取物用少量甲醇溶解，經(jīng)硅膠柱色譜進(jìn)行柱層析，用石油醚∕乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，洗脫組分通過(guò)HPLC 檢測(cè)合并為10 段（Fr.1～Fr.10）?；钚越M分Fr.8（35.2 mg）經(jīng)制備色譜柱（Sunfire C18OBD 制備柱，5 μm，19 mm×250 mm，24 mL∕min）進(jìn)行分離，洗脫梯度為5%～100% 乙腈，洗脫40 min，得到化合物1（7.89 mg）和化合物2（2.86 mg）。

1.5 除草活性測(cè)試

反枝莧、脫殼狗牙根種子經(jīng)除菌處理后以無(wú)菌水反復(fù)振蕩、浸洗5 次以上，移除積水，種子攤開(kāi)置于無(wú)菌操作臺(tái)中吹干，備用。

把經(jīng)過(guò)高壓滅菌后的水瓊脂加入96 孔組織培養(yǎng)板（深孔），冷卻后備用。把準(zhǔn)備好的反枝莧、狗牙根種子分別轉(zhuǎn)接到瓊脂表面，接入種子量以單層種子全部覆蓋水瓊脂表面為準(zhǔn)。將活性跟蹤組分樣品加入5 mL 無(wú)菌水后取20 μL 作為生測(cè)樣品，空白對(duì)照為0.1% 吐溫-80 的無(wú)菌水，重復(fù)3 次［6，7］。培養(yǎng)條件為：溫度20 ℃，相對(duì)濕度70%～80%，每天光照9 h，光照度8 000 lx。從第5 天開(kāi)始檢查并記錄活性，根據(jù)除草活性反應(yīng)的不同，使用分級(jí)指標(biāo)數(shù)（0、3、5、7、9）標(biāo)記除草活性，0 表示沒(méi)有除草活性，株高與空白對(duì)照一致，3、5、7 表示株高分別為空白對(duì)照的70%、50% 以及30%，除草活性依次增強(qiáng)，9 表示除草活性最強(qiáng)，種子沒(méi)有發(fā)芽。

化合物和陽(yáng)性對(duì)照樣品用乙醇配置成10 mg∕mL濃度溶液，然后加入含0.1% 吐溫-80 的無(wú)菌水依次稀釋至100 μg∕mL，以加入等量乙醇和0.1% 吐溫-80 的無(wú)菌水作為空白對(duì)照。將準(zhǔn)備好的種子轉(zhuǎn)移至含無(wú)菌水的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，選取生長(zhǎng)一致的反枝莧或狗牙根放在濾紙上（每皿10 粒），在培養(yǎng)皿中分別加入5 mL 配制好的樣品和空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3 次。培養(yǎng)條件同活性跟蹤組分，4 d 后測(cè)量莖或根的長(zhǎng)度。抑制率=［空白對(duì)照平均根或莖葉長(zhǎng)-處理平均根或莖長(zhǎng)］∕空白對(duì)照平均根或莖長(zhǎng)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末（CH3OH）；C22H25NO8，EIMSm∕z：454.8（［M+Na］+）；1H NMR（CD3OD，500 MHz）δ：8.26（2H，dd，J=7.4，1.5 Hz，H-19，23），7.68（1H，tt，J= 8.0，1.5 Hz，H-22），7.54（2H，dd，J = 8.0，7.4 Hz，H-20，21），6.24（1H，d，J = 9.2 Hz，OH-9），5.75（1H，d，J = 5.6 Hz，OH-10），5.40（1H，m，H-12），4.89（1H，d，J = 5.4 Hz，OH-11），4.46（1H，m，H-10），4.41（1H，d，J = 9.2 Hz，H-9），4.34（1H，t，J= 5.7 Hz，H-11），3.24（3H，s，OCH3-8），2.02（2H，m，H-14），1.64（3H，s，CH3-16），0.88（3H，t，J = 7.5 Hz，CH3-15）；13C NMR（CD3OD，125 MHz）δ：196.6（s，C-4），196.4（s，C-17），186.9（s，C-6），166.5（s，C-2），133.8（d，C-13，21），133.8（s，C-21），133.4（s，C-18），130.3（d，C-19），130.3（d，C-23），129.1（d，C-12），128.4（d，C-20），128.4（d，C-22），111.6（d，C-3），92.5（s，C-5），91.2（s，C-8），74.9（d，C-10），72.0（d，C-9），68.2（d，C-11），51.7（q，OCH3-8），20.7（t，C-14），14.1（q，C-15），5.9（q，C-16）。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］報(bào)道的Pseurotin A 的核磁數(shù)據(jù)基本一致，確定該化合物為Pseurotin A（圖1）。

化合物2：白色粉末（CH3OH）；C15H20N2O4S2，EIMSm∕z：379.7（［M+Na］+）；1H NMR（CD3OD，500 MHz）δ：6.00（1H，m，H-9），5.90（1H，m，H-8），5.64（1H，d，J= 9.7 Hz，H-7），4.83（1H，d，J= 13.7 Hz，H-5a），4.72（1H，d，J = 13.7 Hz，H-6），4.06（1H，dd，J = 11.4，5.3 Hz H-15a），3.73（1H，dd，J = 11.4，6.1 Hz，H-15b），3.12（1H，d，J = 15.6 Hz，H-10a），2.98（3H，s，CH3-13），2.81（1H，dd，J =15.6，1.1 Hz，H-10b），2.21（3H，s，CH3-14），2.19（3H，s，CH3-12）；13C NMR（CD3OD，125 MHz）δ：166.3（s，C-4），165.2（s，C-1），133.1（s，C-9a），130.6（d，C-7），123.5（d，C-8），119.3（d，C-9），73.7（d，C-6），72.8（s，C-3），71.5（s，C-11），69.0（d，C-5a），63.0（t，C-15），38.4（t，C-10），28.3（q，CH3-13），14.7（q，CH3-12），12.8（q，CH3-14）。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］報(bào)道的Bisdethiobis（methylthio）gliotoxin 的核磁數(shù)據(jù)基本一致，確定該化合物為Bis?dethiobis（methylthio）gliotoxin（圖1）。

圖1 化合物的結(jié)構(gòu)

2.2 活性測(cè)試結(jié)果

活性跟蹤組分除草生測(cè)結(jié)果（表1）表明，F(xiàn)r.5和Fr.8 對(duì)狗牙根和反枝莧具有除草活性，F(xiàn)r.5 由于其中的化合物含量低且分離度低，未得到化合物單體，而Fr.8 中得到化合物2 量較少，因此，僅對(duì)化合物1 進(jìn)行了進(jìn)一步的除草活性測(cè)試?；衔锍萆鷾y(cè)結(jié)果（表2）表明，化合物1 對(duì)反枝莧具有除草活性，100 μg∕mL 時(shí)對(duì)反枝莧根的生長(zhǎng)抑制率為32.91%。

表1 活性跟蹤組分對(duì)狗牙根和反枝莧的除草效果

表2 化合物1 對(duì)狗牙根和反枝莧的生長(zhǎng)抑制作用

3 討論

通過(guò)活性跟蹤、大量發(fā)酵及分離純化，從活性菌株NBERC_51984 中得到了化合物Pseurotin A 和Bisdethiobis（methylthio）gliotoxin，通 過(guò)MS、1D 和2D-NMR 確定結(jié)構(gòu)，并對(duì)NMR 數(shù)據(jù)進(jìn)行了歸屬?；钚詼y(cè)試結(jié)果表明，Pseurotin A 對(duì)反枝莧幼苗具有一定的生長(zhǎng)抑制作用。關(guān)于Pseurotin A 除草活性的文獻(xiàn)較少，僅有報(bào)道其對(duì)小扁豆（Lens culinaris）有一定的植物毒性［10］，本試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)Pseurotin A 對(duì)反枝莧具有生長(zhǎng)抑制作用，為除草真菌菌株NBERC_51984 的除草活性物質(zhì)基礎(chǔ)，可對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究，為真菌源除草劑的發(fā)現(xiàn)提供良好的研究基礎(chǔ)。