張志剛，王開梅，吳兆圓，萬中義，方 偉

（湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心∕湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心生物農(nóng)藥分中心，武漢 430064）

除草劑活性評價的方法多種多樣，主要差異在于培養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)條件，但基礎材料只有種子、離體葉片或?qū)嵣纭Ｔ诔輨┗钚栽u價中，根據(jù)活性特點選擇不同的評價方式和培養(yǎng)條件［1，2］。基于水瓊脂培養(yǎng)基的微孔板高通量篩選方法適用于化合物的篩選，在除草劑篩選中應用最多，但可持續(xù)觀察時間短，抗雜菌污染能力差，不適用于雜草致病菌的篩選。微生物源活菌劑的成分復雜，活性化合物和雜草致病菌的發(fā)現(xiàn)同樣重要，篩選方式往往直接決定活性表現(xiàn)。為盡可能地讓不同作用機理的成分充分表現(xiàn)出活性、降低假陰性率，僅使用某一種評價方法是不完整的［3，4］。本試驗比較了幾種除草劑篩選方法的活性反應和可操作性［5］，同時進行了不同類型樣品模擬篩選，旨在找到高效、穩(wěn)定的微生物源活菌除草劑篩選模式。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 種子及實生苗 狗牙根種子發(fā)芽率大于70%，保藏溫度4 ℃。反枝莧種子發(fā)芽率大于95%，保藏溫度4 ℃；室內(nèi)栽培60～80 d 的狗牙根及反枝莧苗；采用直徑4 cm 的微型盆栽培12～14 d 的狗牙根及反枝莧實生苗。

1.1.2 瓊脂粉、培養(yǎng)基原料 瓊脂粉（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司生產(chǎn)，型號為DH010-4），培養(yǎng)土（蛭石與東北黑土混合而成，蛭石∶黑土=3∶1），直徑5、15 cm 的花盆，0.5 mm 的噴筆。

1.1.3 試劑及標準樣品 乙醇、吐溫-80 試劑均為市售分析純化學試劑，除草劑標準化合物樣品乙氧氟草醚、硝磺草酮為市售原藥，單端孢霉素由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心化合物分析室提供。

1.1.4 供篩選試驗樣品 真菌和放線菌發(fā)酵液、提取物由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心微生物工程研究室提供；化學合成化合物由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心化合物分析室提供。

1.1.5 主要儀器、設備 B100-1F 型蠕動泵；KQ-250DE 型數(shù)控超聲波清洗器；High Tech Lab DV8-200，1000 移液器；人工氣候室（光、溫、濕可調(diào)）；經(jīng)過滅菌處理的96 孔組織培養(yǎng)板；日光燈管組（0.4 m距離光照度3 500～4 000 lx）；生物安全柜。

1.2 試驗方法

1.2.1 篩選用樣品的處理 狗牙根、反枝莧種子經(jīng)除菌處理后以無菌水反復振蕩、浸洗5 次以上，移除積水，種子攤開置于無菌操作臺中吹干，備用［6］。

1.2.2 基于瓊脂培養(yǎng)基的微孔板篩選法［7，8］先把0.7% 熱瓊脂分裝到96 孔板中，冷卻備用。將高壓滅菌后的水瓊脂加入96 孔組織培養(yǎng)板（深孔），冷卻后備用。狗牙根、反枝莧種子分別轉(zhuǎn)接到瓊脂表面，接入種子量為20～30 粒∕孔。最后加入待測樣品，加入藥液量為0.02 mL∕孔，置于無菌操作臺中，靜置4 h后移入人工氣候箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度25 ℃，相對濕度70%～80%，每天光照9 h，光照度8 000 lx［9］。

1.2.3 離體葉片法篩選［10］先把0.4% 熱瓊脂分裝到直徑10 cm 培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿加入10 mL，冷卻備用。選擇60～80 d 的狗牙根及反枝莧苗的健康葉片，切取葉片。每個培養(yǎng)皿中加入狗牙根（切取中部葉片，長度2 cm）、反枝莧葉片（完整葉片），各3對葉片正面向下緊貼在水瓊脂表面，備用。每塊葉片上選擇2 處加上0.01 mL 待測樣品，然后移入人工氣候室中培養(yǎng)［11，12］。培養(yǎng)條件為溫度25 ℃，相對濕度90%～100%，每天光照9 h，光照度4 000 lx。

1.2.4 微型盆栽噴霧法篩選［13，14］選用直徑5 cm花盆，提前2 周播種狗牙根、反枝莧。根據(jù)種子發(fā)芽率確定每盆播種量，保證每盆出苗數(shù)在10 株左右，備用。通過低溫強光控制苗高，防止植株生長過快，每個樣品噴霧量為4 mL［15］。培養(yǎng)條件為溫度25 ℃，相對濕度90%～100%，每天光照9 h，光照度4 000 lx。

1.2.5 3 種篩選方法的活性反應試驗

1）活性評價指標［16，17］。不同篩選方法活性表現(xiàn)也不一樣，使用3 種方法統(tǒng)計除草活性，活性以分級法進行統(tǒng)計。一是以株高為指標進行標記，按0、3、5、7、9 分級，0 表示無活性，指標為株高與陰性對照組株高一致，9 表示活性為100%，指標為種子未萌發(fā)，在0 與9 之間設置3 個級別；二是以植株葉片黃化數(shù)為指標進行標記，按0、3、5、7、9 分級，0 表示無活性，指標為葉片黃化數(shù)為0，9 表示活性為100%，指標為葉片黃化數(shù)為100%，在0 與9 之間設置3個級別；三是以葉片受損面積為指標進行標記，按0、3、5、7、9 分級，0 表示無活性，指標為葉片無任何損傷，9 表示活性為100%，指標為葉片受損面積≥樣品液涂布面積，在0 與9 之間設置3 個級別。所有藥效試驗結(jié)果記錄時間為120 h，持續(xù)觀察時間最長為21 d。

2）標準樣品活性反應試驗。3 個標準樣品母液濃度為1.00 mg∕mL，以無菌水稀釋為12 個濃度，每個濃度設2 個重復，試驗重復3 次。

3）不同來源樣品對篩選結(jié)果的影響試驗［18］。選擇不同來源樣品550 個，其中包括10 個化學合成化合物、真菌和放線菌發(fā)酵液各90 個、180 個真菌和放線菌發(fā)酵液相應的上清液及乙酸乙酯提取物。化合物樣品使用濃度為1.00 mg∕mL，發(fā)酵液及上清液直接使用，乙酸乙酯提取物干燥后再用無菌水還原到原發(fā)酵液體積后使用。所有樣品同時使用3 種方法進行篩選，以含0.1% 吐溫-80 無菌水為空白對照，每種篩選方法中每個濃度設2 個重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種篩選方法中標準樣品的活性反應結(jié)果

2.1.1 3 種篩選方法中標準樣品對狗牙根的活性本試驗選擇的3 個標準化合物分別代表微生物除草劑中3 類常見的活性化合物。單端孢霉素的活性特征為無選擇性細胞毒［19］，乙氧氟草醚的活性特征為選擇性芽前或芽后除草劑，在有光的情況下發(fā)揮其除草活性。硝磺草酮的活性特征為抑制羥基苯基丙酮酸酯雙氧化酶（HPPD）引起葉片黃化進而枯死。3種不同方法中同一個樣品對同一靶標的除草活性應該一致，反映在濃度-活性曲線變化趨勢上也應該相近。如圖1a 所示，3 條曲線變化趨勢相近，說明3種方法中單端孢霉素對狗牙根的活性反應一致；圖1b、圖1c 中微孔板法和噴霧法對應的2 條曲線變化趨勢相近，說明這兩種方法中乙氧氟草醚、硝磺草酮的活性反應一致，而離體葉片法相應的曲線與它們差異較大，說明離體葉片法中乙氧氟草醚、硝磺草酮的活性反應與另外2 種方法不一致，且活性反應極弱。

圖1 3 種篩選方法中標準樣品對狗牙根的活性變化曲線

2.1.2 3 種篩選方法中標準樣品對反枝莧的活性如圖2 中所示，分別代表離體葉片法（乙氧氟草醚、硝磺草酮）的2 條曲線與其他7 條曲線差異明顯，說明離體葉片法中乙氧氟草醚、硝磺草酮的活性反應與其他條件下活性反應不一致，且活性反應極弱，該結(jié)果與標準樣品對狗牙根的活性試驗結(jié)果一致。

圖2 3 種篩選方法中標準樣品對反枝莧的活性變化曲線

2.2 不同來源樣品的篩選試驗結(jié)果

2.2.1 3 種篩選方法的有效觀察時間 由于水分揮發(fā)和植物生長對水分的吸收，基于瓊脂培養(yǎng)基的微孔板篩選法培養(yǎng)8 d 后，培養(yǎng)板中水分損失50%，作為培養(yǎng)基質(zhì)的水瓊脂出現(xiàn)明顯縮水，部分幼苗開始脫水。離體葉片法篩選中，從第3 天開始補充無菌水，每3 d 補水1 次。狗牙根離體葉片在7 d 后，空白對照組中狗牙根葉片從切口開始出現(xiàn)持續(xù)擴散的黃化，空白對照組中反枝莧葉片持續(xù)觀察21 d 后仍然正常。微型盆栽噴霧法篩選中，從第3 天開始澆水，每3 d 澆水1 次，持續(xù)觀察生長21 d，空白對照組中狗牙根和反枝莧幼苗生長均正常。

2.2.2 3 種篩選方法中雜菌污染情況 微孔板篩選法中，以目測法對瓊脂表面真菌生長情況及植物生長情況進行觀測。結(jié)果（表1）顯示，微孔板篩選法中不同類型樣品引起狗牙根污染率差異顯著，且發(fā)酵液及上清液樣品引起嚴重的雜菌污染，而化合物及微生物源提取物樣品引起的污染率與空白對照相近；發(fā)酵液及上清液樣品引起的反枝莧雜菌污染率略高于空白對照，而化合物及微生物源提取物樣品不引起雜菌污染。

2.2.3 樣品流動性分析 本試驗中所選擇的550 個不同來源的樣品中，真菌和放線菌都采用液體培養(yǎng)基（含固量3.5%）發(fā)酵。90 個真菌靜置培養(yǎng)發(fā)酵液中63 個樣品中菌絲結(jié)團，取樣困難；90 個放線菌搖瓶發(fā)酵液中46 個樣品中菌絲結(jié)團，取樣困難。其余化合物、上清液和提取物樣品母液流動性好，不影響定量取樣及噴霧。

表1 微孔板篩選法中培養(yǎng)板內(nèi)污染率

3 小結(jié)與討論

與微孔板法和盆栽噴霧法比較，離體葉片法對不同類型化合物的活性反應存在很大的差異性。這些差異與離體葉片細胞的正常代謝、生長幾乎停滯有直接關系。本試驗中未使用針對狗牙根和反枝莧的病原菌標準菌株樣品，所有離體葉片法在病原菌測試中的優(yōu)勢沒有體現(xiàn)，但在生防菌除草劑的實際篩選中，離體葉片法的應用很廣。由于離體葉片法是在一個封閉的微環(huán)境中進行，可以持續(xù)保持適宜的環(huán)境濕度，有利于植物病原菌的萌發(fā)、侵入或寄生，因此離體葉片法對植物病原菌的活性反應較另外2 種方法穩(wěn)定。使用瓊脂作為培養(yǎng)載體的微孔板篩選法更容易實現(xiàn)篩選的高通量，但可持續(xù)觀察時間相對較短，在水分流失和真菌污染的影響得到控制后，篩選結(jié)果穩(wěn)定。盆栽法處在一個開放的環(huán)境中，環(huán)境條件的變化不利于植物病原菌的侵入或寄生，植株也在持續(xù)生長，樣品在植物體中的相對濃度會隨著植株的生長而下降。微生物源活菌除草劑篩選與化學除草劑篩選相比較，活性成分更多樣化（代謝產(chǎn)物或活菌），活性成分對雜草產(chǎn)生活性效果的時間跨度更長，培養(yǎng)條件對活性效果影響更大。在3種篩選法中的活性反應差異性，反映了活性成分的除草機理差異性，分別基于種子、離體葉片和植株的不同篩選方法的聯(lián)合使用是穩(wěn)定、高效的活菌除草劑篩選模式。