王鵬程，方愛(ài)平，屈定斌，彭 新，姜 李，金太星，孫長(zhǎng)城，楊正容，賈 切

（1.湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北 宜昌 443000；2.遠(yuǎn)安縣河口鄉(xiāng)林業(yè)站，湖北 遠(yuǎn)安 444209；3.秭歸縣林業(yè)局，湖北 秭歸 443600；4.秭歸縣郭家壩鎮(zhèn)林業(yè)站，湖北 秭歸 443621；5.興山縣黃糧鎮(zhèn)林業(yè)站，湖北 興山 443701；6.興山縣黃糧鎮(zhèn)農(nóng)技服務(wù)中心，湖北 興山 443701；7.興山縣峽口鎮(zhèn)農(nóng)技服務(wù)中心，湖北 興山 443701；8.五峰土家族自治縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖北 五峰 443413；9.長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025）

核桃（Juglans regiaL.）是世界上四大干果之一。據(jù)文獻(xiàn)［1］記載中國(guó)已有3 000 多年的栽培歷史。由于缺乏良種、無(wú)性繁殖困難，生產(chǎn)一直處于徘徊不前狀態(tài)。20 世紀(jì)90年代，早實(shí)核桃良種選育的成功以及方塊芽接技術(shù)的突破，國(guó)家政策引導(dǎo)和市場(chǎng)驅(qū)動(dòng)，中國(guó)核桃產(chǎn)業(yè)迎來(lái)了前所未有的發(fā)展機(jī)遇。目前，整個(gè)宜昌地區(qū)核桃種植面積近46 萬(wàn)hm2，主要為從外地引進(jìn)的遼核系列、云新系列和清香系列品種。據(jù)調(diào)查，每年4月初宜昌種植的核桃幼枝開(kāi)始出現(xiàn)腐爛病變，感病初期枝條上零散出現(xiàn)大小不一的小黑點(diǎn)。隨著病情的發(fā)展，斑點(diǎn)不斷擴(kuò)大，連成一片，中間稍凹陷，呈不規(guī)則長(zhǎng)條狀。常規(guī)施藥防治效果不佳，給當(dāng)?shù)睾颂疑a(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重影響。為確定病原、精準(zhǔn)施藥、有效控制該病害蔓延，開(kāi)展了病原生物的分離、鑒定及室內(nèi)殺菌劑篩選工作，在分離過(guò)程中獲得2 株鐮刀菌屬（Fusarium）菌株，經(jīng)致病性測(cè)試，可引起核桃幼枝變黑腐爛。

鐮刀菌是一種寄生病原菌，已報(bào)道的鐮刀菌超過(guò)500 種［2］。以菌絲體或分生孢子的形式在土壤中越冬，通過(guò)傷口、皮孔等侵入組織。鐮刀菌可迅速侵入寄主植物的維管組織，導(dǎo)致寄主植株死亡，變黑腐爛，微管組織和周圍海綿組織破裂［3］。黃色鐮刀菌是鐮刀菌屬下的1 個(gè)種，黃色鐮刀菌致病性研究多見(jiàn)于馬鈴薯、大豆和小麥等農(nóng)作物［4-6］，在核桃樹(shù)上浸染未見(jiàn)報(bào)道，擔(dān)心其可能為核桃潛在的新病原，筆者對(duì)該菌種進(jìn)行了形態(tài)和ITS 鑒定，并對(duì)該菌進(jìn)行了常用殺菌劑敏感性測(cè)定，以期為生產(chǎn)上防治該病提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料 在發(fā)病的5月采集當(dāng)年生核桃?guī)Р∮字?，放于自封生物?biāo)本袋中帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌分離。采集健康帶葉幼枝用于回接試驗(yàn)，進(jìn)行致病性檢測(cè)。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉18 g，去離子水1 000 mL。供試殺菌劑及其劑型、生產(chǎn)廠家見(jiàn)表1。

表1 供試殺菌劑

1.1.3 試驗(yàn)儀器、設(shè)備 基因組DNA 快速抽提試劑盒（TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Ex?traction Kit Ver.5.0）、PCR 試劑盒（TaKaRa ExTaq）均購(gòu)自于寶生物工程（大連）有限公司，ITS1∕ITS4 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

E100 型普通光學(xué)顯微鏡，日本Nikon 公司；Mi?crofug?20R centrifuge 高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；9700 型PCR 儀、3730XL 型DNA 測(cè)序儀，美國(guó)ABI 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌分離培養(yǎng) 采用組織分離法［7］進(jìn)行菌種分離。將采回的帶病枝條沖洗干凈消毒，取病健交界處組織塊（4.0 mm×4.0 mm）放入PDA 平板中培養(yǎng)，待菌落形成后，挑取少許菌落邊緣形態(tài)比較單一的菌絲塊轉(zhuǎn)接到新的PDA 平板上培養(yǎng)，如此重復(fù)2～3 次后，挑取形態(tài)比較單一的菌絲小塊移至PDA斜面試管中培養(yǎng)備用。

1.2.2 菌株單孢純化 采用分生孢子稀釋法，菌株在PDA 培養(yǎng)基中連續(xù)暗培養(yǎng)后加無(wú)菌水，用滅菌棉簽輕洗培養(yǎng)菌落，制成分生孢子懸浮液，然后進(jìn)行梯度稀釋，最后將孢子懸浮液均勻涂抹在PDA 培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。再挑取單個(gè)分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生的單菌落，移至PDA 斜面培養(yǎng)備用。

1.2.3 病原菌形態(tài)鑒定 菌絲和孢子形態(tài)觀察，參照張?zhí)煊睿?］的方法，取濾紙剪成長(zhǎng)方形，將中心挖一方孔，滅菌后用無(wú)菌水潤(rùn)濕放于無(wú)菌載玻片上。從PDA 平板邊緣挑取約6 mm 大小的菌餅均勻涂于濾紙中央方孔的邊緣，置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。參照傳統(tǒng)真菌分類方法，初步判定病原菌種類［9］。

1.2.4 病原菌致病性測(cè)定 按照柯赫氏法則，采用離體枝條接種。將新鮮且健康的枝條清洗消毒，放入鋪有濕潤(rùn)滅菌吸水紙的搪瓷盤(pán)中擺放整齊。用消毒針刺傷表皮，用消毒打孔器取直徑4 mm 的菌餅分別接種到刺傷部位，以接入無(wú)菌PDA 為對(duì)照組。用保鮮膜封盤(pán)，保濕培養(yǎng)，每個(gè)菌株接種5 個(gè)。接種后置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中于28 ℃下誘導(dǎo)發(fā)病，2 d后移去菌餅，每天觀察并記錄發(fā)病情況，連續(xù)觀察10 d。發(fā)病后再次從病斑分離培養(yǎng)病原菌，并與原接種菌株進(jìn)行比較。

1.2.5 菌絲DNA 提取及菌種ITS-PCR 鑒定

1）菌絲DNA 提取及凝膠電泳檢測(cè)。用打孔器取直徑6 mm 活化的病原菌菌餅，置于鋪有玻璃紙滅菌的PDA 培養(yǎng)基上，于25 ℃下暗培養(yǎng)3 d。收集玻璃紙上新鮮菌絲，按DNA 提取試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行基因組DNA 提取。取5 μL DNA 溶液，以瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（GelDoc XR+，BIO-RAD）進(jìn)行拍照記錄。

2）ITS-PCR 及序列分析。以基因組DNA 為模板，采用真菌生物核糖體DNA 通用引物ITS1 和ITS4 對(duì)rDNA-ITS 區(qū)域進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：10×PCR Buffer（含MgCl2）5 μL，5 U∕μLTaqDNA 聚合酶0.3 μL，10 mmol∕L dNTPs 2 μL，模板DNA 10 ng，引物ITS1 和ITS4（25 μmol∕L）各1 μL，補(bǔ)ddH2O 使總體積達(dá)到50 μL，在PTC-100 PCR 擴(kuò)增儀（9700 型，美國(guó)ABI 公司）上擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后委托深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行DNA 純化和測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列同源性比對(duì)，利用MEGA7.0 軟件構(gòu)建該ITS 序列與同源ITS 序列的Neighbor-Joining 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)合致病性試驗(yàn)和孢子形態(tài)觀察結(jié)果確定分離菌株種屬特性。

1.2.6 室內(nèi)抑菌藥劑篩選 采用菌絲生長(zhǎng)速率法［10］測(cè)定藥劑對(duì)菌株的抑制效果。用5 種殺菌劑配制成5 個(gè)濃度梯度（表2），將不同濃度藥劑與PDA 培養(yǎng)基充分混勻后制成不同濃度含藥平板，加入等量無(wú)菌水的PDA 平板作為空白對(duì)照。用直徑6 mm 的打孔器取培養(yǎng)5 d 的菌絲餅接種至含藥平板，每個(gè)濃度重復(fù)4 次，置于25 ℃進(jìn)行培養(yǎng)5 d 后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算相對(duì)抑菌率。根據(jù)藥劑系列濃度的Log10 值和抑制率擬合曲線，并計(jì)算出各藥劑EC50［11］。

表2 各供試藥劑濃度梯度

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)特征

從病枝病斑中分離純化獲得1 株有效菌株，編號(hào)為Jf2（圖1）。菌落初期為白色絨毛狀、致密，生長(zhǎng)速度較快，隨著菌絲的蔓延，菌落中間逐漸轉(zhuǎn)為黃棕色。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)基觀察，邊緣菌絲為白色絨毛狀，中間菌絲呈玫瑰紅色。顯微鏡觀察，菌絲有隔，多分枝，分生孢子較大，鐮刀形，少見(jiàn)小型分生孢子。根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》［12］初步判斷為鐮刀屬真菌。

2.2 菌株致病性確定

通過(guò)對(duì)一年生核桃枝條接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Jf2 接種的枝條先后出現(xiàn)黑色斑點(diǎn)，樣本發(fā)病癥狀與標(biāo)本一致，且對(duì)照不發(fā)?。▓D2）。對(duì)接種后發(fā)病的病斑再進(jìn)行分離，獲得的菌株與原病菌一致，因此確定核桃植株莖稈上的病害為Jf2 病原菌所致。

圖1 Jf2 病原菌菌落及分生孢子

圖2 Jf2 接種后枝條發(fā)病癥狀

2.3 菌絲DNA 提取及病原菌分子鑒定

2.3.1 菌絲DNA 提取及凝膠電泳檢測(cè) 提取的DNA 經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，DNA 條帶清晰、明亮，可作為PCR 反應(yīng)的模板（圖3）。以該DNA為模板，用ITS1、ITS4 為引物對(duì)Jf2 的基因組rD?NA-ITS 區(qū)段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段大小為550 bp（圖4）。

圖3 DNA 瓊脂糖凝膠電泳

圖4 rDNA-ITS 擴(kuò)增電泳

2.3.2 序列分析 將測(cè)得的rDNA-ITS 序列與Gen?Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)收錄的序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，結(jié)果表明，菌株Jf2 與F.culmorum同源性最高，同源性達(dá)99%。利用MEGA7.0 軟件通過(guò)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，Jf2 與F. culmorum聚為一支，與其他菌株的遺傳距離較遠(yuǎn)（圖5）。根據(jù)形態(tài)觀察結(jié)果和系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果，將Jf2 菌株鑒定為F.culmorum。

圖5 基于rDNA-ITS 序列構(gòu)建的菌株Jf2 的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.4 室內(nèi)毒力測(cè)定

通過(guò)室內(nèi)毒力測(cè)定，5 種殺菌劑對(duì)黃色鐮刀菌（F.culmorum）均表現(xiàn)出一定的抑制性（表3）。各殺菌劑的防效與濃度對(duì)數(shù)相關(guān)系數(shù)均大于0.8，表明高度相關(guān)。但不同殺菌劑之間EC50相差很大，其中40% 氟硅唑乳油對(duì)黃色鐮刀菌的毒力相對(duì)最強(qiáng)，EC50為0.383 7 μg∕mL；其次為43% 戊唑醇懸乳劑，EC50為9.192 1 μg∕mL；毒力最弱的是70% 甲基硫菌靈可濕性粉劑，EC50為2 010.961 0 μg∕mL。試驗(yàn)結(jié)果表明，40%氟硅唑乳油和43%戊唑醇懸浮劑對(duì)黃色鐮刀菌（F. culmorum）的毒力較強(qiáng)，可用于該病原菌的防控。因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中可考慮用40% 氟硅唑乳油和43% 戊唑醇懸浮劑作為該種病害的主要防治藥劑。

表3 不同殺菌劑對(duì)黃色鐮刀菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

3 小結(jié)與討論

引起核桃枝干發(fā)病的病原生物種類較多，已報(bào)道的有矩圓黑盤(pán)孢（Melanconium oblongum）［13］、胡桃黑盤(pán)孢（M. juglandina）［14］、小新殼梭孢（Neofusicoc?cum parvum）［15］、胡桃 楸擬莖點(diǎn)霉（Phomopsis jug?landina）［16］、莖生擬莖點(diǎn)霉（P.truncicola）［17］、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）［18］、金黃殼囊孢菌（Cy?tospora chrysosperma）［19］等。就鐮刀菌而言，擬枝孢鐮刀菌是鐮刀菌屬中最早報(bào)道的菌種。1985年Cummmings 等［20］第一次從黑核桃潰瘍病中分離到了擬枝孢鐮刀菌（Fusarium sporotrichioides），這也是鐮刀菌屬真菌在核桃中首次被發(fā)現(xiàn)。1986年，劉世騏［21］又從核桃潰瘍病中分離到茄病鐮刀菌（Fusari?um solani），2002年，Belisario 等［22］又從核桃病果中離到了鐮刀菌（Fusariumspp.）。

鐮刀菌在自然界中分布廣泛，種內(nèi)生理分化十分明顯，而且新的種群還在不斷發(fā)現(xiàn)，危害各種作物。宜昌地區(qū)首次從核桃中分離到黃色鐮刀菌，說(shuō)明鐮刀菌屬真菌致病性強(qiáng)，宿主廣泛。王麗麗等［23］利用從馬鈴薯中分離到的銳頂鐮刀菌（F.acuminat?urn）和黃色鐮刀菌（F. culmorum）進(jìn)行室內(nèi)殺毒試驗(yàn)，將供試的8 種殺菌劑分別配制成5 個(gè)濃度梯度，結(jié)果表明作用效果最好的殺菌劑為32.5% 的苯醚甲環(huán)唑。本研究選用5 種常見(jiàn)的化學(xué)殺菌劑，分別配制成5 個(gè)不同濃度的溶液，進(jìn)行黃色鐮刀菌毒力測(cè)定，表明40% 氟硅唑作用效果最好，其次是43%戊唑醇。2 種藥劑對(duì)黃色鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)均有明顯抑制作用。

化學(xué)防治盡可能選擇對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)抑制作用都最強(qiáng)的殺菌劑，盡可能采用混配殺菌劑，防止因?yàn)閱我粴⒕鷦┦┯靡鸬牟≡儺悺Ｈ欢鴼⒕Ч芏喾N因素影響，如周圍環(huán)境溫度、濕度、天氣以及病原菌所處的生理狀態(tài)等，因此生產(chǎn)上選用殺菌劑時(shí)應(yīng)結(jié)合室內(nèi)和田間試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合分析判斷。本試驗(yàn)盡管篩選出了作用效果好的殺菌劑，但試驗(yàn)是在室內(nèi)進(jìn)行的，還需下一步進(jìn)行田間殺菌試驗(yàn)。