秦小兵

（武漢大學醫(yī)學研究院，武漢 430061）

基因組的穩(wěn)定性時刻遭受到各種各樣的損傷威脅，如代謝產(chǎn)物、離子輻射（IR）、紫外線（UV）以及復制錯誤導致的DNA 損傷［1］。細胞內(nèi)常見的DNA 損傷類型有DNA 單連斷裂、DNA 雙鏈斷裂、堿基缺失或錯配、DNA-蛋白交聯(lián)、DNA-DNA 交聯(lián)等損傷類型。這些DNA 損傷如果不能及時修復，會導致許多疾病的產(chǎn)生，如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、惡性膠質(zhì)瘤以及范可尼貧血癥等疾病［2］。因此，細胞必須維持基因組的穩(wěn)定性，為了維持基因組的穩(wěn)定性，細胞會采取許多措施來修復損傷的DNA。細胞維持基因組穩(wěn)定性的措施主要有堿基切除修復（BER）、核苷酸切除修復（NER）、同源重組修復（HRR）以及非同源性末端連接（NHEJ）等方式。

在以上DNA 修復過程中，細胞內(nèi)大量的修復因子參與這些過程，其中許多修復因子在修復過程中會發(fā)生翻譯后修飾，這些修飾與DNA 損傷修復密切相關(guān)，常見的翻譯后修飾包括泛素化、甲基化以及乙?；?。本研究詳細闡述了泛素化修飾在DNA 損傷修復過程中的研究現(xiàn)狀以及相關(guān)進展，從而為相關(guān)疾病的治療和基礎(chǔ)研究提供相應的參考和理論依據(jù)。

1 泛素化修飾

泛素是一種細胞內(nèi)普遍存在的由76 個氨基酸組成的小分子，在細胞內(nèi)可以以游離或者與其他蛋白結(jié)合在一起的狀態(tài)存在［3］。細胞內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生泛素化修飾時需要有泛素激活酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）和泛素連接酶（E3）的參與，此外還需要消耗ATP 分子。蛋白質(zhì)發(fā)生泛素化修飾需要3 個步驟：第一步，E1 消耗1 個ATP 分子將泛素連接到自身的半胱氨酸殘基上從而將泛素活化；第二步，E1 將活化的泛素分子連接到泛素結(jié)合酶E2 上；第三步，泛素結(jié)合酶E2 與泛素連接酶E3 結(jié)合（圖1），從而將泛素分子連接到底物蛋白的賴氨酸殘基上［4-6］。泛素分子與底物蛋白的結(jié)合方式有多種，目前常見的有K6、K11、K27、K29、K33、K48 和K63 等多種結(jié)合方式［7］。

圖1 細胞內(nèi)蛋白質(zhì)泛素化修飾過程

2 泛素化修飾在堿基切除修復中的作用

泛素化修飾在堿基切除修復（BER）、核苷酸切除修復（NER）、同源重組修復（HRR）以及非同源性末端連接（NHEJ）等修復方式中都扮演著重要角色，下面對泛素化修飾在各種機制中的作用進行討論。

DNA 復制時會產(chǎn)生大量的DNA 損傷，這些損傷包括堿基錯配、缺失等情況，因而堿基切除修復（BER）對于維持基因組穩(wěn)定性是非常重要的，DNA復制后修復（PRR）能夠?qū)NA 復制過程中產(chǎn)生的大量的DNA 損傷得到修復，從而維持基因組的穩(wěn)定性。在研究DNA 復制后修復過程中，Rad6（人類細胞中Rad6 對應的蛋白是HR6A∕UBE2A 和HR6B∕UBE2B）是第一個在酵母中發(fā)現(xiàn)的與DNA 復制后修復有關(guān)的蛋白［8］，Rad6 是一個泛素結(jié)合酶（E2），它與泛素連接酶Rad18（E3，人類細胞中對應的是RAD18）一起介導PCNA 的單泛素化修飾。當PCNA 的164 賴氨酸發(fā)生泛素化之后，它會募集參與DNA 損傷修復的DNA 聚合酶，如DNA 聚合酶η、DNA 聚合酶κ 等蛋白到發(fā)生了泛素化修飾的PCNA 上，從而使細胞進行跨損傷合成（TLS）修復途徑［9］。而且有報道稱，在酵母中Rad5（E3，人類細胞中是SHPRH 和HLTF）會與Ubc13-Mms2（E2）一起介導PCNA 的多泛素化修飾，該修飾會促進染色體的復制，從而使得DNA 損傷能通過復制產(chǎn)生的姐妹染色單體來進行修復，即通過同源重組這條途徑來修復損傷的DNA［10］（圖2）。

圖2 泛素化在堿基切除修復中的功能

DNA 在復制或是轉(zhuǎn)錄過程中，DNA 的鏈間會發(fā)生一些交聯(lián)（ICLs），這種交聯(lián)如果不能得到及時修復，會影響基因的復制和轉(zhuǎn)錄等過程，從而引起疾病的發(fā)生，這種交聯(lián)是依賴于堿基切除修復的方式進行修復的。而在范可尼貧血癥患者中，由于缺少DNA 交聯(lián)修復的相關(guān)蛋白，因而這些病人的轉(zhuǎn)錄和復制過程都會受到影響［2］。目前，發(fā)現(xiàn)這些病人中有15 個等位基因會發(fā)生突變，這些基因統(tǒng)稱為FA，這些基因的產(chǎn)物是在DNA 交聯(lián)修復的最初3 個步驟中起作用，他們的作用包括鏈間交聯(lián)（ICLs）的識別和剪切、跨損傷合成（TLS）以及介導同源重組修復（HRR）［11］。在復制的過程中，當復制叉遇到DNA 交聯(lián)時，復制叉會停止，進而使得FA 復合體募集到損傷位點。FA 復合體的1 個亞基FANCL 是1個E3 泛素連接酶，該酶可使FANCD2-FANCI 這個復合體發(fā)生單泛素化修飾，發(fā)生泛素化修飾之后就為后續(xù)的修復因子提供了1 個平臺［12］，而且FANCD2-FANCI 發(fā)生泛素化修飾之后可使自身更容易錨定到染色質(zhì)上并且與其他的一些修復因子結(jié)合到一起［13，14］，泛素化的FANCD2 會被核酸內(nèi)切酶FAN1 識別，進而對發(fā)生交聯(lián)損傷的DNA 進行剪切，從而保證受損的DNA 被切除，使得后續(xù)DNA 修復過程繼續(xù)，如同源重組（HR）和跨損傷修復（TLR）等修復方式得以進行（圖3）。

圖3 泛素化修飾在DNA 交聯(lián)修復中的功能

3 泛素化修飾在核苷酸切除修復中的作用

當細胞暴露在紫外線的照射下或其他一些化學藥物條件下時，DNA 會產(chǎn)生嘧啶二聚體和環(huán)丁烷嘧啶二聚體這2 種常見損傷，此時DNA 損傷需要利用核苷酸切除修復（NER）損傷的DNA。核苷酸切除修復有2 種主要途徑：一種是全基因組范圍內(nèi)的修復，這種修復發(fā)生在整個基因組中；一種是轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的修復，這種修復方式主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄的DNA模板鏈上［15］。

在全基因組堿基切除修復發(fā)生的過程中，UVDDB（與UV 引起損傷的DNA 結(jié)合非常緊密且特異性很高的結(jié)合因子）和XPC-RAD23（全基因組核苷酸切除修復所必須的識別因子）這2 個復合體會檢測到DNA 的損傷［10］。該過程首先是當UV-DDB 復合體檢測到損傷時，它會募集XPC-RAD23 到損傷位點。而UV-DDB 這個復合體會與CUL4A∕B（一類疏水蛋白家族，可以為E3 泛素連接酶提供支架作用）這個蛋白質(zhì)形成1 個具有E3 泛素連接酶功能的復合體［15］，該復合體使組蛋白發(fā)生單泛素化的同時使DDB2 和XPC 發(fā)生多泛素化修飾［16］。研究發(fā)現(xiàn)，在紫外線損傷DNA 時，泛素化的DDB2 并沒有結(jié)合DNA 的活性，而且DDB2 的泛素化修飾介導了DDB2 被蛋白酶體的降解［17］。而XPC 發(fā)生泛素化修飾后表現(xiàn)出與DNA 結(jié)合的活性，特別是當DNA被紫外線損傷之后，結(jié)合活性表現(xiàn)出增加的情況，而且XPC 被RAD23（與蛋白酶體發(fā)生結(jié)合的蛋白）保護而不被降解［18］，同時被泛素化的XPC 在DNA損傷位點會募集TFIIH（轉(zhuǎn)錄因子2H，核苷酸切除修復因子之一）到損傷位點參與核苷酸切除修復（圖4）。

圖4 泛素化修飾在全基因組核苷酸切除修復中的功能

在轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的堿基切除修復發(fā)生過程中，首先是細胞會激活轉(zhuǎn)錄異常引起核苷酸切除修復反應，接著會發(fā)生泛素化修飾、RNA 聚合酶2 的降解等事件。轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的堿基切除修復主要依賴于科凱恩綜合征蛋白B（CSB，與RNA 聚合酶2 結(jié)合的蛋白）。該蛋白除了在堿基切除修復中引起DNA 重塑之外，它還會募集科凱恩綜合征蛋白A（CSA）到損傷位點，接著這2 個蛋白和DDB1 與CUL4 一起組成1 個具有E3 泛素連接酶活性的復合體，該復合體形成后會使ATF3 發(fā)生泛素化修飾，ATF3 發(fā)生泛素化修飾之后，會被蛋白酶體降解，該過程會使RNA 聚合酶2 重新開始轉(zhuǎn)錄過程［19，20］。接著在后續(xù)招募的蛋白中，有部分蛋白是參與DNA 修復的關(guān)鍵因子，而其中1 個蛋白Rsp5 是E3 泛素連接酶（哺乳動物中是NEDD4），它會與Uba1（E1）、Ubc5（E2）一起介導RNA 聚合酶2 發(fā)生K-63 的泛素化從而導致其降解［21］，RNA 聚合酶2 降解之后轉(zhuǎn)錄終止，DNA 開始后續(xù)修復機制（圖5）。

圖5 泛素化修飾在轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的堿基切除修復中的功能

另外，E3 泛素連接酶RNF8 也是一個在DNA損傷扮演著重要功能的蛋白。有研究指出，RNF8與Ube2S∕Ube2C 介導的組蛋白的K11 位泛素化修飾對于DNA 損傷修復很重要。該泛素化修飾同樣是在DNA 損傷發(fā)生后，對終止正在轉(zhuǎn)錄的RNA 聚合酶2 介導的RNA 轉(zhuǎn)錄是必須的［7］，這樣在DNA損傷位點，細胞就能將RNA 聚合酶2 從損傷位點解離下來，以便于DNA 損傷修復因子參與損傷DNA 的修復。

4 泛素化修飾在DNA 雙鏈斷裂修復中的作用

DNA 雙鏈斷裂（DSB）是細胞內(nèi)最嚴重的DNA損傷，DNA 雙鏈斷裂有同源重組修復（HRR）和非同源性末端連接（NHEJ），同源重組修復（HRR）是一種精確的修復機制，而非同源性末端連接（NHEJ）則是一種易錯的修復機制。在DNA 雙鏈斷裂修復過程中，當細胞檢測到DNA 發(fā)生損傷時，組蛋白H2AX會 發(fā) 生 磷 酸 化 而 形 成γH2AX［22］，MDC1 會 識 別γH2AX 并被募集到損傷位點，當MDC1 被募集到損傷位點時，ATM 將MDC1 磷酸化，磷酸化的MDC1會被E3 泛素連接酶RNF8 所識別［23］。接著E3 泛素連接酶RNF168 也被募集到該位點，當RNF8 和RNF168 都被募集到損傷位點后，會引起H2A 發(fā)生K13∕K15 泛素化修飾，K13∕K15 泛素化修飾發(fā)生之后DNA 雙鏈斷裂修復的相關(guān)因子，如53BP1、RAD18、BRCA1、RAP80 復合體（也稱作BRCA1-A）以及EXPAND（EXPAND 在DNA 修復中的作用可使DNA 處于松散狀態(tài)）等因子會被募集到DNA 損傷位點［24］，當53BP1 被募集到該位點并且被RAD18進行泛素化修飾后，53BP1 與染色質(zhì)的結(jié)合更加緊密，有助于DNA 損傷的修復。緊接著這些因子會參與到DNA 損傷修復，而這些不同因子之間的相互作用會使細胞決定選擇使用非同源性末端連接（NHEJ）還是同源重組（HR）來進行修復，如53BP1募集到DNA 損傷位點時會使細胞用非同源性末端連接（NHEJ）進行修復，而當BRCA1 募集到損傷位點時，細胞會傾向于使用同源重組（HR）這條修復途徑（圖6）。

圖6 泛素化修飾在DNA 雙鏈斷裂修復中的功能（一）

在DNA 雙鏈斷裂修復過程中，除了RNF8 和RNF168 這2 個E3 泛素連接酶被募集到損傷位點之外，RNF20 和RNF40 這2 個蛋白也會以ATM 依賴的方式募集到DNA 損傷位點，RNF20 和RNF40會 引 起 組 蛋 白H2B 的K120 泛 素 化 修 飾［25］。當RNF20 和RNF40 引起H2B 的K120 泛素化修飾之后，該修飾會促進染色質(zhì)的解聚，從而為修復因子提供接近損傷染色質(zhì)的空間［26，27］，這些修復因子包含了參與同源重組修復（HRR）和非同源性末端連接（NHEJ）這2 種修復方式的修復因子［28］。在修復過程中，除了RNF20 和RNF40 會引起H2B K120 的泛素化修飾外，E3 泛素連接酶BMI1∕RING2 在DNA雙鏈斷裂位點會依賴于NBS1（MRN 復合體中的蛋白之一）而被募集到損傷位點，該過程接著會引起H2A∕H2AX 的K119 泛 素 化 修 飾，H2A∕H2AX 的K119 泛素化修飾產(chǎn)生之后會使E3 泛素連接酶RNF168 更容易定位到損傷位點，但是RNF168 到該位點之后是否會對BMI1∕RING2 催化產(chǎn)生的泛素化修飾起加強作用并不清晰［29］，RNF168 會使組蛋白H2A 的13 位和15 位賴氨酸發(fā)生泛素化修飾，此外，RNF168 還會使H2A 發(fā)生K63 泛素化修飾，因此，當RNF168 被募集到損傷位點之后會催化H2A產(chǎn)生K63 泛素化修飾，該修飾會幫助RAP80 也被募集到損傷位點，而RAP80 會幫助其他的DNA 損傷修復因子進入損傷位點參與DNA 損傷修復［30］（圖7）。

此外，BRCA1 在同源重組（HR）修復途徑中會和BARD1 形成1 個異源二聚體來泛素化H2A 的127 位和129 位賴氨酸，K127∕129 的泛素化修飾會在同源重組修復過程中促進損傷DNA 的末端進行切割而形成黏性末端［31］，從而保證鏈侵入過程順利發(fā)生，使得損傷的DNA 能夠從姐妹染色單體上找到互補序列進行修復。BRCA1 參與修復過程會受到許多機制的調(diào)節(jié)，Baranes-Bachar 等［32］研究中提到 了UBE4A 這 個E3∕E4 泛 素 連 接 酶，UBE4A 以53BP1 依賴的方式被募集到DNA 雙鏈斷裂的位點，接著使組蛋白發(fā)生K48 和K63 連接的泛素化修飾，緊接著RAP80 會被募集到發(fā)生K63 修飾的這個位點，之后它會募集BRCA1，從而組成BRCA1-A 復合體（包括BRCA1、RAP80、ABRAXAS 和MERIT40等蛋白）。UBE4A 也會幫助BRCA1-A 向BRCC 復合體（包括BRCA1、BRCA2、PALB2、RAD51 等蛋白）轉(zhuǎn)化，當BRCA1-A 轉(zhuǎn)化成BRCC 復合體之后，BRCC 復合體會促進RAD51 在DNA 雙鏈斷裂位點的結(jié)合，從而使得同源重組修復繼續(xù)進行［7］。

圖7 泛素化修飾在DNA 雙鏈斷裂修復中的功能（二）

5 小結(jié)與展望

DNA 作為細胞的遺傳物質(zhì)，控制著細胞的每一個生理過程，同時DNA 也是細胞內(nèi)每個生理過程的基礎(chǔ)，如果DNA 發(fā)生損傷，對于細胞來說將是致命的。DNA 損傷會造成DNA 的突變，而產(chǎn)生的這些突變會導致機體產(chǎn)生癌癥等各種疾病。因而，準確理解DNA 損傷以及DNA 損傷的修復機制對于相關(guān)疾病的治療具有重要的指導意義，目前通過靶向DNA 損傷相關(guān)蛋白來治療疾病的藥物已經(jīng)有部分得以應用。而泛素化修飾在DNA 損傷修復過程中的作用暗示著許多泛素化修飾相關(guān)的蛋白可能是潛在的治療靶點，因此，對近幾十年來報道過的DNA 損傷修復過程中起關(guān)鍵作用的泛素化修飾過程和相關(guān)蛋白進行總結(jié)，可以為相關(guān)疾病的治療和基礎(chǔ)研究提供相應的理論依據(jù)。