曹文超,張青林

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院麻醉科,北京 100026;*通訊作者,E-mail:qinglinzhanglynn@163.com)

子癇前期(preeclampsia,PE)是一種妊娠期婦女特有疾病,以血壓升高和蛋白尿?yàn)樘卣?該病對(duì)孕婦及胎兒危害較大,嚴(yán)重時(shí)甚至危及生命[1]。研究表明,滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入過(guò)淺以及胎盤(pán)蛻膜部位血管發(fā)育障礙進(jìn)而導(dǎo)致的胎盤(pán)缺血缺氧是引起PE的重要原因[2]。PE發(fā)生后,滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲、增殖能力下降且過(guò)度凋亡[3,4]。目前,滋養(yǎng)層細(xì)胞一直是探究PE發(fā)病的熱點(diǎn)與重點(diǎn),因此,探究滋養(yǎng)層細(xì)胞生物學(xué)行為的變化對(duì)于明確PE發(fā)病的具體機(jī)制具有重要意義。

當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn),在PE發(fā)病中,多種microRNA的表達(dá)發(fā)生改變[5,6]。Mouillet等[7]研究發(fā)現(xiàn),miR-205在缺氧條件下的滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng),但其具體如何參與PE發(fā)病和對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞是否有影響目前尚未明確。細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子1C(cyclin-dependent kinase inhibitor 1C,CDKN1C)也被稱為P57KIP2,其能夠抑制大多數(shù)CDK-cyclin激酶活性,以往研究證實(shí)其在乳腺癌、胃癌、卵巢癌等癌癥中表達(dá)下調(diào)[8-10]。劉廣鈺等[11]研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)P57KIP2使滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力明顯增強(qiáng)。本研究從滋養(yǎng)層細(xì)胞生物學(xué)行為改變的角度出發(fā),探討miR-205-5p靶向CDKN1C在調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞中的作用,進(jìn)而發(fā)現(xiàn)參與PE的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

HTR8-SVneoh購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù);DMEM/F12培養(yǎng)基(PM150110)、胎牛血清(SFBS)均購(gòu)自上海語(yǔ)純生物科技有限公司;lipofectamin2000試劑盒(11668027)、Trizol試劑(15596026)、細(xì)胞裂解液(78501)均購(gòu)自Thermo Fisher公司;雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒(ab228530),一抗CDKN1C(ab75974)、Bax(ab32053)、Bcl-2(ab185002)、TGF-β1(ab92486)、Vimentin(ab92547)、N-cadherin(ab18203)、E-cadherin(ab194982),二抗山羊抗兔IgG(ab6721)均購(gòu)自Abcam公司;焦炭酸二乙酯(1609-47-8)購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(BPI01030)購(gòu)自北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司;qRT-PCR試劑盒(QP015)購(gòu)自艾美捷科技有限公司;BCA試劑盒(P0010)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;SDS凝膠(P1200-25T)購(gòu)自北京索萊寶;多聚甲醛(30525-89-4)購(gòu)自南京化學(xué)試劑股份有限公司;碘化丙啶(25535-16-4)購(gòu)自上海穎心實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司;紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)(SP-3803AA)購(gòu)自上海光譜儀器有限公司;酶標(biāo)儀(HBS-1096B)購(gòu)自南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;倒置顯微鏡(MX62)購(gòu)自?shī)W林巴斯;流式細(xì)胞儀(CytoFLEX)購(gòu)自Beckman公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組轉(zhuǎn)染

人類滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR8-SVneo置于DMEM/F12培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中并在37 ℃、5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)3 d。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HTR8-SVneo細(xì)胞按密度3×105/ml接種于96孔板中。將細(xì)胞分為下列幾組:NC組(negative control,轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列)、miR-205-5p mimic組(轉(zhuǎn)染miR-205-5p mimic)、miR-205-5p inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-205-5p inhibitor)、CDKN1C組(轉(zhuǎn)染CDKN1C過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒)、miR-205-5p mimic+CDKN1C組(共同轉(zhuǎn)染miR-205-5p mimic和CDKN1C過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒),按照l(shuí)ipofectamin2000試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-205-5p與CDKN1C的靶向關(guān)系

通過(guò)靶向關(guān)系網(wǎng)站miR WALK(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)驗(yàn)證CDKN1C與miR-205-5p存在結(jié)合位點(diǎn),然后通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證CDKN1C與miR-205-5p之間的靶向關(guān)系。實(shí)驗(yàn)步驟依據(jù)雙熒光素酶試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,之后檢測(cè)熒光素酶活性。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)目的因子的mRNA表達(dá)水平

在各組細(xì)胞中加入Trizol試劑對(duì)總RNA進(jìn)行提取,加入焦炭酸二乙酯水對(duì)總RNA充分溶解后,采用紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定260 nm與280 nm下的吸光度值,鑒定RNA的質(zhì)量及濃度。借助逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,cDNA通過(guò)85 ℃溫浴滅活逆轉(zhuǎn)錄酶3 min后,依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行后續(xù)PCR反應(yīng)。miR-205-5p的相對(duì)表達(dá)水平以U6作為內(nèi)參,其余因子以GAPDH作為內(nèi)參。2-ΔΔCt法測(cè)定RNA表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中各因子蛋白表達(dá)水平

在細(xì)胞中加入冰上預(yù)冷的細(xì)胞裂解液裂解30 min后,用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品在100 ℃水浴變性3 min,上樣,行SDS-凝膠電泳,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,將含5%脫脂奶粉的TBST的放于PVDF膜上封閉1 h。棄封閉液,加入一抗CDKN1C(1 ∶1 000)Bax(1 ∶1 500)、Bcl-2(1 ∶1 000)、TGF-β1(1 ∶1 000)、Vimentin(1 ∶1 500)、N-cadherin(1 ∶1 500)及E-cadherin(1 ∶1 500)后于冰箱過(guò)夜,將一抗與封閉液倒掉,TBST漂洗3次,加入二抗山羊抗兔IgG(1 ∶1 000),室溫孵育1 h,TBST漂洗3次。通過(guò)ECL進(jìn)行顯影,Image J軟件檢測(cè)蛋白條帶的表達(dá)。

1.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化,將細(xì)胞懸液以104個(gè)/孔接種于96孔板中,將其放在5% CO2、37 ℃環(huán)境下進(jìn)行孵育。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)24,48,72 h后每孔加入MTT溶液20 μl(5 mg/ml),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng),去培養(yǎng)液。使用酶標(biāo)儀測(cè)量570 nm處各孔OD值。

1.7 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲情況

將完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)置于Transwell小室的下室,收集重懸好的細(xì)胞液加入Transwell小室的上室(100 μl/室),在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室,擦去上室上層細(xì)胞,多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色。借助倒置顯微鏡隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察穿膜細(xì)胞數(shù)并拍照。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,在4 ℃條件下離心、棄上清后,將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106/ml,以2 ml每孔接種于96孔板上,用Anexin Ⅴ-FITC染液進(jìn)行避光染色20 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-205-5p靶向抑制CDKN1C的表達(dá)

靶向關(guān)系網(wǎng)站miR WALK發(fā)現(xiàn)miR-205-5p與CDKN1C存在結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)圖1A),雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-205-5p mimic顯著抑制CDKN1C-3′UTR-WT的熒光素酶活性(P<0.05,見(jiàn)圖1B);對(duì)CDKN1C-3′UTR-MUT的熒光素酶活性沒(méi)有明顯影響。

圖1 miR-205-5p與CDKN1C靶向關(guān)系驗(yàn)證Figure 1 Verification of the targeting relationship between miR-205-5p and CDKN1C

2.2 抑制miR-205-5p或過(guò)表達(dá)CDKN1C促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖

MTT檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn):相對(duì)于NC組,miR-205-5p inhibitor組和CDKN1C組中細(xì)胞增殖活力顯著增強(qiáng)(均P<0.05);miR-205-5p mimic組中細(xì)胞增殖活力顯著下降(P<0.05);miR-205-5p mimic+CDKN1C組中細(xì)胞增殖活力變化不顯著(P>0.05,見(jiàn)圖2)。

2.3 抑制miR-205-5p或過(guò)表達(dá)CDKN1C促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況發(fā)現(xiàn):相較于NC組,miR-205-5p inhibitor組和CDKN1C組中細(xì)胞凋亡降低(均P<0.05);miR-205-5p mimic組中細(xì)胞凋亡顯著增加(P<0.05,見(jiàn)圖3)。

與NC組相比,*P<0.05;與miR-205-5p mimic+CDKN1C組比較,#P<0.05圖2 抑制miR-205-5p或過(guò)表達(dá)CDKN1C對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響Figure 2 Effect of miR-205-5p inhibitoror CDKN1C overexpression oncell proliferation activity

與NC組比較,*P<0.05;與miR-205-5p mimic+CDKN1C組比較,#P<0.05圖3 抑制miR-205-5p或過(guò)表達(dá)CDKN1C對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Figure 3 Effect of miR-205-5p inhibitor or CDKN1C overexpression on cell apoptosis

2.4 抑制miR-205-5p或過(guò)表達(dá)CDKN1C后Bcl-2、TGF-β1表達(dá)上升,Bax表達(dá)下降

qRT-PCR與Western blot檢測(cè)顯示:與NC組相比,miR-205-5p inhibitor組和CDKN1C組中CDKN1C、Bcl-2、TGF-β1表達(dá)上升,Bax表達(dá)下降;miR-205-5p mimic組中CDKN1C、Bcl-2、TGF-β1表達(dá)顯著降低,Bax表達(dá)顯著升高(均P<0.05,見(jiàn)圖4)。miR-205-5p mimic+CDKN1C組中各項(xiàng)指標(biāo)與NC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

2.5 抑制miR-205-5p或過(guò)表達(dá)CDKN1C促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲

Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲結(jié)果顯示:與NC組比較,miR-205-5p inhibitor組和CDKN1C組中細(xì)胞侵襲數(shù)目增多(均P<0.05);miR-205-5p mimic組中細(xì)胞侵襲數(shù)目減少(均P<0.05,見(jiàn)圖5)。miR-205-5p mimic+CDKN1C組中細(xì)胞侵襲與NC組差異不顯著(均P>0.05)。

與NC組相比,*P<0.05;與miR-205-5p mimic+CDKN1C組比較,#P<0.05圖4 qRT-PCR和Western blot檢測(cè)抑制miR-205-5p或過(guò)表達(dá)CDKN1C后Bcl-2,TGF-β1,Bax的變化Figure 4 Expression of Bcl-2,TGF-β1,Bax aftertreatment with miR-205-5p inhibitor or CDKN1C overexpressionby qRT-PCR and Western blot

與NC組相比,*P<0.05;與miR-205-5p mimic+CDKN1C組比較,#P<0.05圖5 抑制miR-205-5p或過(guò)表達(dá)CDKN1C對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響 (×100)Figure 5 Effect of miR-205-5p inhibitor or CDKN1C overexpression on cell invasion ability (×100)

2.6 抑制miR-205-5p或過(guò)表達(dá)CDKN1C促進(jìn)HTR-8/SVneo細(xì)胞系上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子Vimentin、N-cadherin及E-cadherin的表達(dá)發(fā)現(xiàn):相較于NC組,miR-205-5p inhibitor組與CDKN1C組中Vimentin、N-cadherin表達(dá)上升,E-cadherin表達(dá)下降;miR-205-5p mimic組中Vimentin、N-cadherin表達(dá)顯著增加,E-cadherin表達(dá)顯著降低(均P<0.05,見(jiàn)圖6)。miR-205-5p mimic+CDKN1C組與NC組中各項(xiàng)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

與NC組相比,*P<0.05;與miR-205-5p mimic+CDKN1C組比較,#P<0.05圖6 Western blot檢測(cè)抑制miR-205-5p或過(guò)表達(dá)CDKN1C后上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)Figure 6 Effect of miR-205-5p inhibitor or CDKN1C overexpression onexpression of proteins related to epithelial-mesenchymal transition by Werstern blot

3 討論

PE作為胎盤(pán)源性疾病,發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,相關(guān)臨床和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),胎盤(pán)中滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入不足是PE發(fā)病的中心環(huán)節(jié)[12]。因此,促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、侵襲,減少其凋亡對(duì)治療PE是十分重要的。本研究通過(guò)探究miR-205-5p在PE發(fā)病中的作用,尋找治療PE的潛在靶點(diǎn)。

miRNA參與調(diào)控很多重要的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程,包含細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡等[13]。目前,miRNA在PE中的作用越來(lái)越受到關(guān)注,如許燕濱等[14]研究發(fā)現(xiàn)miR-17-5p在PE發(fā)病中呈現(xiàn)高表達(dá);另外也有研究證實(shí),過(guò)表達(dá)miR-16能夠促進(jìn)PE中間充質(zhì)干細(xì)胞的凋亡并減少滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲[15]。miR-205-5p在PE中的作用目前尚未明確,只是有相關(guān)研究揭示miR-205在缺氧條件下?lián)p傷滋養(yǎng)層細(xì)胞[7]。在探究miR-205的作用時(shí),大部分文獻(xiàn)資料集中在腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域,研究表明,過(guò)表達(dá)miR-205能夠抑制腫瘤細(xì)胞中生長(zhǎng)、增殖、遷移[16,17]。而滋養(yǎng)層細(xì)胞是一種具有高增殖特點(diǎn)的細(xì)胞,與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性類似,本研究通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)過(guò)表達(dá)miR-205-5p能夠抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和侵襲,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

人類印記基因的表達(dá)主要是在胎盤(pán)中,調(diào)控胎盤(pán)與胎兒生長(zhǎng)及發(fā)育[18]。CDKN1C作為一種母源表達(dá)、父源印記的印記基因,促進(jìn)細(xì)胞的分化,其表達(dá)影響女性的整個(gè)妊娠期,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)其在PE患者胎盤(pán)中表達(dá)降低[19,20]。本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí),CDKN1C是miR-205-5p的靶基因。TGF-β1是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的重要因子,影響妊娠期女性胎盤(pán)的發(fā)育及功能作用,此外TGF-β1能夠促進(jìn)人滋養(yǎng)層細(xì)胞的分化[21,22]。本研究通過(guò)檢測(cè)各組滋養(yǎng)層細(xì)胞相關(guān)因子發(fā)現(xiàn),抑制miR-205-5p或過(guò)表達(dá)CDKN1C后,Bcl-2、TGF-β1表達(dá)上升,Bax表達(dá)下降;細(xì)胞的增殖活力與侵襲能力增強(qiáng);細(xì)胞的凋亡率下降。過(guò)表達(dá)miR-205-5p則變化與之相反,同時(shí)miR-205-5p的作用能夠被過(guò)表達(dá)CDKN1C所挽救。這進(jìn)一步證明抑制miR-205-5p或過(guò)表達(dá)CDKN1C能在滋養(yǎng)層細(xì)胞中起保護(hù)作用。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有增殖、遷移能力的間質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程,伴隨上皮細(xì)胞的標(biāo)志物(E-cadherin、Cytokeratin)的喪失,間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(Vimentin、N-cadherin)表達(dá)[23,24]。滋養(yǎng)層細(xì)胞的浸潤(rùn)機(jī)制與EMT過(guò)程密切相關(guān),EMT過(guò)程受阻會(huì)造成胎盤(pán)功能障礙進(jìn)而誘發(fā)PE[25]。本研究通過(guò)抑制miR-205-5p或過(guò)表達(dá)CDKN1C實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),E-cadherin表達(dá)下降,Vimentin、N-cadherin表達(dá)上升,從而促進(jìn)EMT的發(fā)生,進(jìn)而影響滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和侵襲。

綜上所述,抑制miR-205-5p的表達(dá)能夠促進(jìn)CDKN1C表達(dá),提高滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、侵襲能力,促進(jìn)EMT的發(fā)生。因此,miR-205-5p可能參與PE的發(fā)病,有望成為治療PE的關(guān)鍵靶點(diǎn)。