劉 通,史靜怡,王 利,閆泱錦,程 康,冀永春

(西安市第三醫(yī)院,西北大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,西安 710018;*通訊作者,E-mail:18629057123@163.com)

缺血性心肌病(ischemic cardiomyopathy,ICM)屬于冠心病的一種特殊類型,是指由冠狀動脈粥樣硬化而引起長期心肌缺血,導(dǎo)致患者心肌彌漫性纖維化,產(chǎn)生與原發(fā)性擴張型心肌病類似的臨床綜合征[1],其是嚴(yán)重危脅人類健康的主要疾病之一[2]。隨著冠心病發(fā)病率的不斷增加,ICM對人類健康所造成的危害也日漸嚴(yán)重。目前對其治療主要是及時有效的恢復(fù)血流,搶救“瀕死”的心肌[3]。但是,再灌注過程會對心肌造成一定的損傷,這種損傷被稱為心肌缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury,I/R),該損傷因嚴(yán)重影響心肌梗死再灌注治療的效果而逐漸成為研究重點[4]。研究表明,細(xì)胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷中起著重要作用。細(xì)胞凋亡中3條主要途徑(線粒體、死亡受體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng))中線粒體途徑為細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近年來,通過調(diào)節(jié)線粒體通路抑制心肌細(xì)胞凋亡是研究心肌缺血損傷的一大重點[5]。β2腎上腺素受體(β2-adrenergic receptors,β2AR)在I/R中具有重要的作用[6]。研究發(fā)現(xiàn),在心肌缺血時,過度激動β2AR,導(dǎo)致心臟氧耗增多,最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死,激動β1受體促進凋亡,而激動β2受體有抗凋亡作用[7]。Clenbuterol是選擇性β2受體激動劑,張秋芳等[8]發(fā)現(xiàn)在心梗后長期聯(lián)合應(yīng)用β2腎上腺受體阻斷劑clenbuterol可提高生存率,對心肌細(xì)胞有保護作用。由此,我們推測clenbuterol可能通過激動β2受體對I/R損傷具有保護作用,且主要是通過線粒體細(xì)胞凋亡途徑發(fā)揮作用。因此本研究通過建立在體大鼠心肌缺血再灌注損傷模型在整體和細(xì)胞水平研究β2腎上腺素能受體激動劑(clenbuterol)對I/R中線粒體細(xì)胞凋亡途徑的影響,以期為冠心病的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

戊巴比妥鈉(Sigma,USA),TTC(Sigma-Aldrich),RNA提取試劑盒(Invitrogen,USA)RT-PCR試劑盒(Fermetas),線粒體蛋白提取試劑盒(wla034a)、BCA蛋白定量試劑盒(wla004a),ELISA試劑盒(Sigma Aldrich),LDH和CK-MB(南京建成生物工程研究所),抗體AR-β2(Abcam)、Bax(Abcam)、Caspase-3(Abcam)、Cx43(Abcam)和PKC-ε(Abcam),電壓依賴性陰離子通道蛋白1(voltage-dependent anion channel protein 1,VDAC1)兔抗大鼠多克隆抗體(沈陽萬類,wl02790)。

1.2 實驗方法

1.2.1 急性心肌缺血再灌注損傷大鼠模型的制備與分組 45只體質(zhì)量為250-300 g的成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠購自兵器工業(yè)衛(wèi)生研究所[SCXK(陜)2016-001],隨機分為假手術(shù)組、模型組和實驗組,每組15只。大鼠經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉(1.5 ml/kg)麻醉后,進行氣管插管,調(diào)節(jié)呼吸頻率為90次/min,潮氣量11 ml/kg,連接心電監(jiān)護儀,于大鼠胸骨左側(cè)第3、4肋間做手術(shù)切口,暴露心臟,剝離心包膜,采用7-0帶線縫合針于左心耳下緣1 cm處穿過待結(jié)扎加壓。假手術(shù)組大鼠不結(jié)扎加壓,僅在假手術(shù)開始前通過腹腔注射給予生理鹽水(4 ml/kg);模型組大鼠在結(jié)扎前通過腹腔注射給予生理鹽水(4 ml/kg)并開始計時,觀察到心電圖ST段持續(xù)弓背抬高,確定心肌缺血成功,30 min后輕抽魚線再灌注3 h[9]。實驗組大鼠在結(jié)扎前5 min通過腹腔注射給予clenbuterol(0.5 mg/kg),后續(xù)處理同模型組。再灌注結(jié)束后收集大鼠心臟和血液,進行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.2.2 指標(biāo)觀察與組織學(xué)檢查 通過測量Ⅱ?qū)?lián)心電圖同步監(jiān)測所有組別大鼠結(jié)扎30 min后的心電圖表現(xiàn),并與術(shù)前心電圖比較,觀察大鼠心電圖有無再灌注心律失?，F(xiàn)象。取各組大鼠左室心尖部組織進行多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,再經(jīng)過二甲苯脫蠟,經(jīng)無水乙醇、95%乙醇和80%乙醇逐級漂洗,行蘇木素一伊紅(HE)染色,于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.3 線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 大鼠造模結(jié)束取血后迅速剪下心臟,以生理鹽水灌洗后在冰上分離左心室,取一小塊組織置入2.5%戊二醛固定液中,并在固定液中迅速將其剪為體積約1 mm3的小塊,經(jīng)過脫水、滲透、包埋聚合、切片等步驟,于透射電鏡下找到心肌細(xì)胞內(nèi)的線粒體進行觀察并拍照。

1.2.4 心肌酶檢測 造模結(jié)束后剪開頸部皮膚,分離頸靜脈并以一次性醫(yī)用取血管取血。血液靜置30 min后置入離心機,以3 000 r/min離心10 min,血清移入EP管中,應(yīng)用全自動生化分析儀測定各組血清中肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase MB,CK-MB)及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)的含量。

1.2.5 RNA提取和RT-PCR檢測 通過Trizol法從大鼠心肌組織細(xì)胞中提取總RNA,然后將純化的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。再通過RT-PCR試劑盒定量檢測β2AR的mRNA表達水平。使用Thermo Fisher的Applied Biosystems實時熒光定量PCR儀器進行檢測,采用的軟件為Mx3000P,PCR程序為:95 ℃預(yù)熱10 min,95 ℃ 15 s,55 ℃退火1 min,40個循環(huán)反應(yīng)。引物序列:β2AR,F:5′-CAGCAAAGGGACGAGGTG-3′,R:5′-AAGTAATGGCAAAGTAGCG-3′;GAPDH,F:5′-CGTGCGTGACATTAAGGAG-3′,R:5′-GGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3′。GAPDH作為內(nèi)參,通過2-ΔΔCt方法檢測基因相對表達水平。

1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡分析 用RIPA法從大鼠心肌組織細(xì)胞中提取總蛋白,以線粒體蛋白提取試劑盒提取線粒體蛋白,于4 ℃ 10 000g離心5 min。BCA測定法測量蛋白質(zhì)含量,用8%-12% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)樣品(50 μg),并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。然后將膜用TBST中的5% BSA封閉,并與β2AR(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、Caspase-3(1 ∶1 000)、Cx43(1 ∶1 000)、PKC-ε(1 ∶500)和電壓依賴性陰離子通道蛋白1(VDAC1)兔抗大鼠多克隆抗體(1 ∶1 000)第一抗體在4 ℃下孵育過夜,然后將膜用TBST洗滌,并與HRP偶聯(lián)的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000)或HRP偶聯(lián)的山羊抗小鼠抗體在37 ℃孵育1 h。使用ECL蛋白質(zhì)印跡檢測試劑觀察蛋白質(zhì)條帶,并計算灰度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

使用SPSS21.0分析數(shù)據(jù),所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,兩組數(shù)據(jù)采用t檢驗比較差異性,多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析差異性。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型組大鼠心電圖變化

模型組大鼠結(jié)扎后,ST段顯著上移,T波增高,表現(xiàn)出心律失常現(xiàn)象,而再灌注之后,ST段和T波與結(jié)扎時相比顯著下降,但與結(jié)扎前相比仍有增加(P<0.01,見表1),表明心肌缺血再灌注大鼠模型構(gòu)建成功。

表1 模型組大鼠心肌缺血再灌注前后心電圖的變化 (mV)

2.2 β2腎上腺素能受體激動劑對大鼠心肌組織的病理改變影響

HE染色結(jié)果表明,假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)無變化,皮質(zhì)神經(jīng)元顯示正常結(jié)構(gòu);模型組大鼠核固縮,核周體顯著增加,出現(xiàn)眾多的空泡空間;與模型組相比,實驗組心肌細(xì)胞壞死明顯減少,心肌纖維可見輕度水腫,可見核的殘留神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)得到改善(見圖1)。

2.3 大鼠心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察

透射電鏡下可見,假手術(shù)組大鼠神經(jīng)元和細(xì)胞器的外觀形態(tài)正常,線粒體形態(tài)和大小正常;模型組大鼠線粒體腫脹、變形嚴(yán)重,膜結(jié)構(gòu)模糊;實驗組大鼠膜結(jié)構(gòu)模糊,線粒體略有腫脹,神經(jīng)元損傷較輕(見圖2)。該結(jié)果提示β2腎上腺素能受體激動劑clenbuterol可以有效減輕大鼠心肌缺血再灌注造成的線粒體超微結(jié)構(gòu)的損傷。

2.4 大鼠心肌組織中β2AR的表達

與模型組相比,實驗組大鼠心肌組織中β2AR的mRNA和蛋白相對表達量顯著上調(diào)(P<0.05,見圖3)。表明β2腎上腺素能受體激動劑clenbuterol能夠激活β2AR的表達。

圖1 大鼠心肌組織HE染色結(jié)果 (×200)Figure 1 HE staining results of rat myocardial tissue (×200)

圖2 腎上腺素能受體激動劑clenbuterol對大鼠心肌缺血再灌注后線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響 (×2 000)Figure 2 Effect of clenbuterol on ultrastructure of mitochondria after myocardial ischemia-reperfusion injury in rats (×2 000)

A.各組大鼠中β2AR mRNA的相對表達水平 B.各組大鼠中β2AR蛋白的相對表達水平與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05圖3 腎上腺素能受體激動劑clenbuterol對大鼠心肌組織中β2AR的mRNA和蛋白表達的影響Figure 3 Effect of clenbuterol on β2AR mRNA and protein expression in myocardial tissues in each group

2.5 大鼠血清中心肌酶檢測分析

與假手術(shù)組比較,模型組和實驗組大鼠血清中CK-MB和LDH含量顯著升高(P<0.05);與模型組比較,實驗組大鼠血清中CK-MB和LDH含量顯著降低(P<0.05,見圖4)。提示β2腎上腺素能受體激動劑clenbuterol能顯著降低大鼠心肌缺血再灌注導(dǎo)致的急性心肌損傷。

與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05圖4 腎上腺素能受體激動劑clenbuterol對大鼠心肌缺血再灌注后血清中心肌酶水平的影響Figure 4 Effect of clenbuterol on serum myocardial enzyme level after myocardial ischemia-reperfusion in rats

2.6 大鼠心肌細(xì)胞凋亡因子與線粒體蛋白表達分析

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心肌組織中Bax和Caspase-3蛋白表達水平顯著上調(diào)(P<0.05);與模型組比較,實驗組大鼠心肌組織中Bax和Caspase-3蛋白表達水平顯著下調(diào)(P<0.05,見圖5)。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心肌組織中Cx43和PKC-ε蛋白表達水平明顯下調(diào)(P<0.05);與模型組比較,實驗組大鼠心肌組織中Cx43和PKC-ε蛋白表達水平顯著上調(diào)(P<0.05,見圖5)。提示β2腎上腺素能受體激動劑clenbuterol在大鼠心肌缺血再灌注過程中可能通過上調(diào)Cx43和PKC-ε蛋白表達而抑制線粒體細(xì)胞的凋亡。

與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05圖5 腎上腺素能受體激動劑clenbuterol對大鼠心肌細(xì)胞凋亡因子與線粒體蛋白表達的影響Figure 5 Effect of clenbuterol on the expression levels of rat cardiomyocyte apoptosis factors and mitochondrial proteins

3 討論

心肌缺血對心肌產(chǎn)生一定損傷,目前常見的治療方式為再灌注,但是再灌注過程可進一步加重心肌的損傷,從而引起一系列病癥[10],因此通過不同治療緩解損傷是目前研究的重點。而相關(guān)研究主要是通過建立大鼠缺血再灌損傷模型實現(xiàn),主要是由于具有大鼠冠狀動脈分支少、用于制備缺血再灌損傷模型復(fù)制性好、模型成功率高等優(yōu)勢[11]。本實驗構(gòu)建大鼠心肌缺血再灌注模型,發(fā)現(xiàn)β2腎上腺素能受體激動劑clenbuterol可明顯降低心肌缺血損傷癥狀,且發(fā)現(xiàn)這種治療作用上調(diào)了β2AR基因表達,緩解了線粒體損傷以及調(diào)控線粒體內(nèi)蛋白Cx43、PKC-ε以及細(xì)胞凋亡因子Caspase-3和Bax的表達,因此推測clenbuterol治療作用可能主要是通過抑制線粒體細(xì)胞凋亡實現(xiàn)。

LDH和CK-MB是細(xì)胞損傷程度的標(biāo)志[12],其存在于心肌細(xì)胞內(nèi),只有當(dāng)細(xì)胞膜受損,通透性發(fā)生改變時才會出現(xiàn)外漏,所以通常檢測和來評價細(xì)胞損傷的程度[13]。本實驗結(jié)果表明,clenbuterol可降低心肌缺血再灌后造成的心肌損傷,即與模型組相比,clenbuterol治療可顯著降低大鼠血清中LDH和CK-MB的釋放量,這說明clenbuterol對缺血再灌注后的心肌細(xì)胞有保護作用,這與前人的報道一致[8]。

心肌細(xì)胞在缺血缺氧條件下會發(fā)生線粒體功能障礙[14]、線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C釋放進入胞質(zhì)并啟動線粒體凋亡途徑[15]。本研究通過透射電鏡觀察各組中線粒體情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),clenbuterol能緩解線粒體損傷,這與前人結(jié)果一致。Bax是線粒體膜上調(diào)節(jié)細(xì)胞色素C通透性的分子[16],其主要通過增加細(xì)胞色素C的釋放并起到促凋亡作用[17],進入胞質(zhì)的細(xì)胞色素C通過級聯(lián)反應(yīng)來激活Caspase-3并引起細(xì)胞凋亡[18],本實驗中,模型組中Bax和Caspase-3的表達水平均明顯高于假手術(shù)組,提示心肌缺血再灌注能夠?qū)е滦募〖?xì)胞的線粒體凋亡途徑發(fā)生激活。而實驗組大鼠心肌組織中Bax和Caspase-3的表達水平均明顯低于模型組。另外,研究表明,線粒體Cx43及PKC-ε在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞內(nèi)ATP敏感性鉀通道及MitoKATP通道中起著重要作用[19],其中MitoKATP通道在干預(yù)心肌缺血再灌注損傷中起關(guān)鍵作用[20],因此,本實驗檢測了線粒體中Cx43及PKC-ε蛋白的表達量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),clenbuterol顯著上調(diào)了線粒體中Cx43及PKC-ε蛋白的表達量,表明β2腎上腺素能受體激動劑clenbuterol能夠抑制心肌缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞線粒體途徑凋亡。

綜上所述,β2腎上腺素能受體激動劑clenbuterol能夠減輕心肌缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損害、抑制再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞線粒體途徑凋亡,且這種抑制主要是通過上調(diào)線粒體中Cx43及PKC-ε蛋白以及抑制細(xì)胞凋亡因子Bax和Caspase-3的表達來發(fā)揮作用。