胡翠芳,陳夢雨,黃寅虎,王 婧,邱 英

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院婦產(chǎn)科,重慶 400042;*通訊作者,E-mail:aloukti@126.com)

卵巢癌是全世界最常見的婦科腫瘤之一,盡管卵巢癌的診斷和治療得到較大的進(jìn)展,然而卵巢癌患者的5年生存率仍然很低[1,2]。卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制尚未闡明,深入探討卵巢癌的分子機(jī)制對卵巢癌的臨床診療方案具有重要意義。微小RNA(miRNA)是一種內(nèi)源性的非編碼小分子RNA,與惡性腫瘤細(xì)胞的浸潤、增殖、轉(zhuǎn)移等行為有關(guān),參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[3,4]。越來越多的研究表明,miRNA可作為卵巢癌的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn),為卵巢癌的臨床診療提供新的思路[5,6]。有研究顯示,miR-6838-5p在三陰性乳腺癌細(xì)胞系表達(dá)水平降低,是一種腫瘤抑制因子[7]。迄今為止,miR-6838-5p在其他腫瘤如卵巢癌中的調(diào)控作用研究甚少。本研究旨在觀察miR-6838-5p在卵巢癌中是否存在異常表達(dá),探討miR-6838-5p影響卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移的分子機(jī)制,為臨床上卵巢癌的基因治療提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源

選擇2018年3月至2019年11月于我院行手術(shù)切除且經(jīng)病理確診的39例卵巢癌及癌旁組織?；颊咂骄挲g(52.31±7.12)歲,患者術(shù)前均未接受放化療或其他輔助治療。本研究通過了本院倫理委員會批準(zhǔn),患者均簽署了知情同意書。

1.2 細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)試劑

5種卵巢癌細(xì)胞株(OC3、SKOV-3、OVCAR-3、A2780、HO-8910)和正常卵巢上皮細(xì)胞株(IOSE80)購自美國ATCC公司。DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司。qRT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。Transwell小室購自美國Corning公司。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒、miR-6838-5p模擬物、NC模擬物、PPM1D mRNA野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒購自上海賽默飛世爾科技有限公司。引物購自上海生工生物科技服務(wù)有限公司。CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、結(jié)晶紫染液購自上海碧云天生物科技有限公司。Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司。抗β-actin、PPM1D、MAPK、p-ERK、p-JNK抗體均購自美國Santa Cruze公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

OC3、OVCAR-3細(xì)胞在體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),IOSE80、SKOV-3、A2780、HO-8910細(xì)胞在體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據(jù)處理方法不同將OVCAR-3細(xì)胞分為兩組,根據(jù)Lipofectamine 3000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。陰性對照組:轉(zhuǎn)染NC模擬物;miR-6838-5p組:轉(zhuǎn)染miR-6838-5p模擬物。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-6838-5p和PPM1D mRNA的相對表達(dá)量

采用Trizol法分別提取組織及細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,qRT-PCR擴(kuò)增檢測組織或細(xì)胞miR-6838-5p和PPM1D mRNA的表達(dá)水平。miR-6838-5p以U6為內(nèi)參,PPM1D mRNA以GAPDH為內(nèi)參。qRT-PCR擴(kuò)增引物序列見表1。qRT-PCR反應(yīng)體系和條件參照說明書進(jìn)行操作,miR-6838-5p和PPM1D mRNA的相對表達(dá)量根據(jù)2-ΔΔCt方法計(jì)算。

表1 qRT-PCR擴(kuò)增引物序列

1.5 CCK-8法檢測OVCAR-3細(xì)胞增殖

將轉(zhuǎn)染后的各組OVCAR-3細(xì)胞以3×103個(gè)/孔接種于96孔板,每孔培養(yǎng)基200 μl,每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。每孔加入20 μl CCK-8溶液,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)3 h,酶標(biāo)儀測定每孔在450 nm波長處的吸光度值。每天測1次,連續(xù)測5 d,實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.6 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測OVCAR-3細(xì)胞遷移

收集轉(zhuǎn)染后的各組OVCAR-3細(xì)胞,用不含F(xiàn)BS的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸至5×105個(gè)/ml,取200 μl細(xì)胞懸液接種于Transwell上室,下室加入含F(xiàn)BS的RPMI-1640培養(yǎng)基600 μl,每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。用4%多聚甲醛固定30 min,用0.2%結(jié)晶紫溶液染色30 min,棉簽擦去膜上層的細(xì)胞。倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)膜下層的細(xì)胞數(shù)并拍照,實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.7 生物信息學(xué)技術(shù)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

采用miRGator、microRNA.org、miRNApath等生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-6838-5p的靶基因。構(gòu)建靶基因野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒,將OVCAR-3細(xì)胞接種于96孔板,分別將野生型質(zhì)粒、突變型質(zhì)粒與miR-6838-5p模擬物或NC模擬物共轉(zhuǎn)染至OVCAR-3細(xì)胞,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒分析螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性。

1.8 Western blot檢測OVCAR-3細(xì)胞中PPM1D蛋白表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染后的各組OVCAR-3細(xì)胞,于冰上裂解細(xì)胞并提取總蛋白。BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度,各組取等量蛋白樣品進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,在5%脫脂牛奶中封閉1 h。TBST溶液洗膜后,加入一抗β-actin(1 ∶2 000)、PPM1D(1 ∶1 000)、MAPK(1 ∶1 000)、p-ERK(1 ∶1 000)、p-JNK(1 ∶1 000),4 ℃過夜孵育。TBST溶液洗膜后,加入二抗(1 ∶5 000),以ECL顯影液化學(xué)發(fā)光,在暗室成像拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-6838-5p在卵巢癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)水平

qRT-PCR結(jié)果顯示,miR-6838-5p在卵巢癌組織和癌旁組織中相對表達(dá)水平分別為1.16±0.31和5.23±0.65。與癌旁組織相比,卵巢癌組織中miR-6838-5p表達(dá)水平降低(P<0.01,見圖1)。與正常卵巢上皮細(xì)胞株(IOSE80)相比,miR-6838-5p的表達(dá)水平在各卵巢癌細(xì)胞株中均降低(P<0.05),其中在OVCAR-3細(xì)胞株中表達(dá)最低(P<0.01,見圖2)。

與癌旁組織相比,**P<0.01圖1 卵巢癌組織和癌旁組織中miR-6838-5p表達(dá)Figure 1 The expression of miR-6838-5p in ovarian cancer tissues and adjacent tissues

與IOSE80細(xì)胞株相比,*P<0.05,**P<0.01圖2 卵巢癌細(xì)胞株和正常卵巢上皮細(xì)胞株中miR-6838-5p表達(dá)Figure 2 The expression of miR-6838-5p in ovarian cancer cell lines and normal ovarian epithelial cell lines

2.2 轉(zhuǎn)染后miR-6838-5p的表達(dá)

陰性對照組和miR-6838-5p組OVCAR-3細(xì)胞miR-6838-5p相對表達(dá)水平分別為1.00±0.05和9.72±0.82。與陰性對照組相比,miR-6838-5p組miR-6838-5p表達(dá)水平升高(P<0.01),表明miR-6838-5p模擬物轉(zhuǎn)染成功。

2.3 過表達(dá)miR-6838-5p抑制OVCAR-3細(xì)胞增殖

CCK-8法顯示,第2,3,4,5天,miR-6838-5p組OVCAR-3細(xì)胞吸光度值明顯低于陰性對照組(P<0.05,見圖3),表明過表達(dá)miR-6838-5p可抑制OVCAR-3細(xì)胞增殖。

2.4 過表達(dá)miR-6838-5p抑制OVCAR-3細(xì)胞遷移

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示,陰性對照組和miR-6838-5p組膜下層細(xì)胞數(shù)分別為(142.60±10.90)個(gè)和(53.82±9.35)個(gè)。與陰性對照組相比,miR-6838-5p組遷移的細(xì)胞數(shù)低于陰性對照組(P<0.01,見圖4),表明過表達(dá)miR-6838-5p可抑制OVCAR-3細(xì)胞遷移。

與陰性對照組相比,*P<0.05,**P<0.01圖3 過表達(dá)miR-6838-5p對OVCAR-3細(xì)胞增殖的影響Figure 3 The effect of miR-6838-5p overexpression on the proliferation of OVCAR-3 cells

2.5 生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測miR-6838-5p的靶基因

miRGator、microRNA.org、miRNApath等軟件預(yù)測顯示,miR-6838-5p的靶基因可能是PPM1D,miR-6838-5p與PPM1D mRNA互補(bǔ)序列見圖5。

2.6 miR-6838-5p對PPM1D mRNA靶向調(diào)控驗(yàn)證

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示,與共轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒+NC模擬物相比,共轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒+miR-6838-5p模擬物的相對熒光素酶活性明顯降低(P<0.01)。與共轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒+NC模擬物相比,共轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒+miR-6838-5p模擬物的相對熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖6),表明miR-6838-5p和PPM1D mRNA能夠靶向結(jié)合。

與陰性對照組相比,**P<0.01圖4 過表達(dá)miR-6838-5p對OVCAR-3細(xì)胞遷移的影響Figure 4 The effect of miR-6838-5p overexpression on the migration of OVCAR-3 cells

圖5 miR-6838-5p與PPM1D mRNA互補(bǔ)的序列Figure 5 The complementary sequence of miR-6838-5p and PPM1D mRNA

2.7 轉(zhuǎn)染后PPM1D mRNA的表達(dá)

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示,陰性對照組和miR-6838-5p組OVCAR-3細(xì)胞中PPM1D mRNA表達(dá)分別為1.02±0.12和0.24±0.08,兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),表明miR-6838-5p可抑制PPM1D mRNA的表達(dá)。

2.8 過表達(dá)miR-6838-5p對PPM1D蛋白表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)顯示,過表達(dá)miR-6838-5p后,OVCAR-3細(xì)胞中PPM1D蛋白表達(dá)降低,MAPK信號通路中MAPK、p-ERK、p-JNK表達(dá)水平顯著降低(見圖7)。

與野生型+NC相比,**P<0.01圖6 miR-6838-5p與PPM1D mRNA雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果Figure 6 Results of dual luciferase reporter gene of miR-6838-5p and PPM1D mRNA

圖7 過表達(dá)miR-6838-5p對OVCAR-3細(xì)胞PPM1D蛋白表達(dá)的影響Figure 7 The effect of miR-6838-5p overexpression on PPM1D protein expression in OVCAR-3 cells

3 討論

微小RNA(miRNA)通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)互補(bǔ)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后層面抑制靶基因的表達(dá),調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等多種生理過程,參與疾病的發(fā)生、發(fā)展,與腫瘤的形成密切相關(guān)[8,9]。大量研究表明,miRNA如miR-205、miR-758-3p、miR-145、miR-200c、miR-128在卵巢癌中表達(dá)水平降低或增加,通過靶向調(diào)節(jié)某些關(guān)鍵癌基因或抑癌基因,在卵巢癌的各種惡性生物學(xué)行為中扮演重要角色[10-13]。Liu等[7]研究發(fā)現(xiàn),miR-6838-5p在三陰性乳腺癌中表達(dá)水平降低,通過調(diào)節(jié)下游靶基因表達(dá)影響Wnt信號通路活化,抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,低表達(dá)miR-6838-5p促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,miR-6838-5p具有抑癌性。

本研究發(fā)現(xiàn),miR-6838-5p在卵巢癌組織中相對表達(dá)水平顯著低于癌旁組織。與正常卵巢上皮細(xì)胞相比,miR-6838-5p的表達(dá)水平在各卵巢癌細(xì)胞系中均明顯降低。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),過表達(dá)miR-6838-5p后,卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞的增殖能力和遷移能力均減弱。以上結(jié)果表明,miR-6838-5p在卵巢癌中是一種抑癌基因。miRNA對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用,取決于miRNA的靶基因[14]。miRNApath、microRNA.org、miRGator等軟件預(yù)測顯示,PPM1D可能是miR-6838-5p的靶基因。進(jìn)一步探討miR-6838-5p與PPM1D的靶向關(guān)系,雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-6838-5p與PPM1D mRNA存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn),miR-6838-5p能夠靶向結(jié)合PPM1D mRNA,PPM1D是miR-6838-5p的靶基因。PPM1D基因位于染色體17q23.3區(qū)域,PPM1D蛋白是一種具有絲/蘇氨酸酶活性的蛋白磷酸酶,包含605個(gè)氨基酸[15]。多種實(shí)體腫瘤如乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、甲狀腺乳頭狀癌、結(jié)腸癌中均檢測到PPM1D蛋白表達(dá)增加,敲除PPM1D基因可通過阻滯MAPK信號通路,顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,表明PPM1D基因是一種癌基因[16-19]。MAPK信號通路在調(diào)控卵巢癌細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展過程中異常激活,與患者的不良預(yù)后相關(guān)[20]。Western blot結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-6838-5p后,MAPK信號通路中MAPK、p-ERK、p-JNK表達(dá)水平顯著降低,表明miR-6838-5p可通過靶向PPM1D抑制MAPK信號通路的激活。

綜上所述,miR-6838-5p在卵巢癌組織和細(xì)胞株中表達(dá)水平降低,miR-6838-5p作為抑癌基因可靶向調(diào)控PPM1D基因的表達(dá),抑制MAPK信號通路的激活,抑制卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞的增殖和遷移,本研究可能為卵巢癌的分子靶向治療提供一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。