熊仕俊， 孫成龍， 黃 波， 吳奇飛， 龍忠銀

(1.安順學(xué)院 農(nóng)學(xué)院， 貴州 安順 561000； 2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)， 貴州 貴陽 550025)

草莓褐色葉斑病是一種新發(fā)現(xiàn)的草莓病害，在田間表現(xiàn)為葉片壞死和果實(shí)腐爛。2012年國內(nèi)首次報(bào)道了病原菌Pilidiumconcavum在北京地區(qū)危害草莓導(dǎo)致草莓褐色葉斑病[1]。該病原菌首次在日本發(fā)現(xiàn)危害草莓，之后在波蘭、巴西、比利時(shí)、美國和伊朗等地也有陸續(xù)報(bào)道[2-5]。目前，未見貴州草莓褐色葉斑病病原鑒定的相關(guān)報(bào)道。

通過常規(guī)的組織分離法對病原菌進(jìn)行分離純化，采用形態(tài)學(xué)觀察和rDNA-ITS序列分析相結(jié)合的方法，對分離到的草莓褐色葉斑病病原菌進(jìn)行鑒定，旨在查明貴州草莓褐色葉斑病病原菌的種類，為進(jìn)一步探究其發(fā)生傳播規(guī)律以及防控研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料采集

2018年11月至2019年6月，在貴州省貴陽市(花溪區(qū)三五三七廠、青巖)、遵義市播州區(qū)(八里、鴨溪)、安順市西秀區(qū)(大寨村、羅仙村)等地的草莓基地，采集有典型褐色葉斑病癥狀的草莓病株，每個點(diǎn)采集3～5株，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。

1.2 病原菌的分離保存

采用常規(guī)的組織分離法[6]分離病原菌。從發(fā)病組織病健交界處，切取5 mm×5 mm的組織小塊，先放在75%酒精中 5～60 s進(jìn)行表面消毒，隨后用5%次氯酸鈉中浸泡3～5 min，再放在無菌水中清洗3次，用滅菌濾紙吸干組織表面水分后，將其轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基上，于25℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)3～5 d。待其在培養(yǎng)基上長出菌落后，挑取菌落邊緣菌絲或單孢分離的方法進(jìn)行純化和轉(zhuǎn)接培養(yǎng)病原菌。

按照柯赫氏法則[6]進(jìn)行回接，回接后表現(xiàn)出與田間病葉相似褐色病斑癥狀，再進(jìn)行病原菌的分離與純化，于滅菌蒸餾水中4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌的鑒定

采用形態(tài)學(xué)觀察與rDNA-ITS序列分析相結(jié)合的方式鑒定病原菌。

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察 將純化的病原菌接種在PDA平板上，觀察并記錄其在PDA平板上的生長狀況、菌落顏色、菌絲特征等培養(yǎng)性狀。將病原菌接種在TPDA(胰蛋白胨馬鈴薯葡萄糖瓊脂)[7]平板上，7 d后通過光學(xué)顯微數(shù)碼成像系統(tǒng)觀察菌絲形態(tài)、分隔狀態(tài)，孢子的大小、形態(tài)與顏色等。綜合上述形態(tài)特征，參照《真菌鑒定手冊》[8]《植物病害診斷》[9]對菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類。

1.3.2 rDNA-ITS序列分析 采用 CTAB法提取病原菌的基因組DNA，用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和 ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[1]進(jìn)行rDNA-ITS-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂凝膠電泳檢測后，送廣州擎科公司測序，測序結(jié)果登錄GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行 BLAST比對，利用ClustalX和Paup軟件分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離

從不同批次的發(fā)病草莓植株葉部共分離到8株病原真菌，編號分別為Y1、QH、HF-1、HF-2、HF-3、YH-1、YH-2、YH-3；采用離體接種法按照柯赫氏法則進(jìn)行回接，設(shè)置無傷和針刺2組處理?；亟雍髢HY1出現(xiàn)致病現(xiàn)象，其余編號的菌株回接后，未出現(xiàn)感病現(xiàn)象(或現(xiàn)象不明顯)。初步確定Y1為疑似草莓褐色葉斑病病原菌，針刺處理表現(xiàn)出與田間病葉相似褐色病斑癥狀。

2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)

Y1在PDA培養(yǎng)基上生長緩慢，產(chǎn)孢量極少，28℃恒溫培養(yǎng)5 d后菌落直徑約5 cm，菌落厚實(shí)，菌絲致密、白色，絨毛狀，菌落邊緣整齊，初期菌落中央淡褐色，后期菌落邊緣為淡褐色、中心逐漸變?yōu)辄S褐色，培養(yǎng)基背面變?yōu)樯铧S褐色(圖1)。在TPDA上培養(yǎng)7 d后，鏡檢發(fā)現(xiàn)病原菌菌絲無色、有隔膜；分生孢子卵圓形，頂生，單胞，無色，光滑，大小為(3.5～11.8)μm×(1.5～3.8)μm(圖2)。

2.3 病原菌的rDNA-ITS序列

將病原菌菌株Y1總DNA提取后，進(jìn)行rDNA-ITS基因測序，將測序結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對分析發(fā)現(xiàn)，菌株與Pilidiumlythri的序列相似度高達(dá)97%?；诓糠諭TS序列，利用Paup軟件，以菠菜炭疽病菌(Colletotrichumspinaciae)和束狀刺盤孢菌(Colletotrichumtrichellum)為外群，經(jīng)過分子系統(tǒng)發(fā)育分析，病原菌菌株Y1與Pilidiumlythri聚到一起，從進(jìn)化分支上分析Y1與Pilidiumseptatum、Pilidiumeucalyptorum距離較遠(yuǎn)(圖3)。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定引起貴州草莓褐色葉斑病的病原為Pilidiumlythri。

3 討論

研究對引起貴州草莓褐色葉斑病的病原菌進(jìn)行了鑒定，綜合形態(tài)學(xué)觀察與ITS序列分析，確定為Pilidiumlythri。P.lythri在貴州侵染草莓引起草莓褐色葉斑病屬于首次報(bào)道，國內(nèi)目前僅在北京地區(qū)發(fā)現(xiàn)該病菌危害草莓[1]。

趙新蘭等[10]研究發(fā)現(xiàn)，P.lythri與P.concavum二者是同一病原真菌的共無性型。P.concavum寄主范圍廣泛，除危害草莓外，還可危害牡丹(Paeonsuffruticosa)[5]、厚葉巖白菜(Bergeniacrassifolia)[11]、草甸水蘭(Hieraciumcaespitosum)[12]、橄欖(Oleaeuropaea)[13]、虎杖(Fallopiajaponica)[14]、歐洲李(Prunusdomestica)[15]等，該病害發(fā)病初期在葉片中央或邊緣形成圓形、水浸狀、褐色病斑，后期病斑逐漸擴(kuò)大，褐色至黑褐色，中間灰白色，邊緣淡褐色，形成肉眼可見的同心輪紋。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病害在葉片上發(fā)病迅速，可侵染果實(shí)，導(dǎo)致全果腐爛。在草莓生產(chǎn)上應(yīng)合理輪作和加強(qiáng)田間管理，從而減少該病菌對草莓的危害。