王艷　劉光斌　金文麗　何苗苗　謝靜

?研究探索辛芷滴鼻液、燒燙寧膏兩種含中藥的制劑微生物限度檢查法，進(jìn)一步做方法學(xué)驗(yàn)證。用平皿法進(jìn)行需氧菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù);用常規(guī)法進(jìn)行控制菌檢查。?5種試驗(yàn)菌株回收率值在0.5?2范圍內(nèi)，滿足《中國(guó)藥典》2015版四部微生物限度檢查法方法驗(yàn)證試驗(yàn)的要求。?本研究建立的方法操作簡(jiǎn)便，可用于兩種制劑的微生物限度檢查。

：辛芷滴鼻液;燒燙寧膏;微生物限度檢查;驗(yàn)證

辛芷滴鼻液是酒鋼醫(yī)院研制的用于治療慢性、萎縮性、過(guò)敏性鼻炎的一種含中藥滴鼻劑;燒燙寧膏用于治療Ⅰ、Ⅱ度以下燒燙傷。鼻炎癥狀嚴(yán)重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量，尤其是在西北寒冷地區(qū)，氣候干燥，晝夜溫差大，鼻炎發(fā)病率高，給患者帶來(lái)不可忽視的生活困擾，為此我院根據(jù)中醫(yī)理論和臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)專門研發(fā)了便于使用和攜帶的中藥滴鼻劑辛芷滴鼻液，臨床反應(yīng)療效明顯。而燒燙寧膏則是針對(duì)輕度的燒燙傷治療的一種必要的補(bǔ)充制劑，滿足臨床需求。這兩種制劑中均含有不同成分的中藥提取液，因此在對(duì)其進(jìn)行微生物限度的質(zhì)量檢查過(guò)程中，應(yīng)先查驗(yàn)中藥成分是否具有抑菌性，從而建立有效的微生物限度檢查方法。由于這兩種制劑均為油性制劑，辛芷滴鼻液以麻油為基質(zhì)，燒燙寧膏則是油性軟膏，本文在對(duì)這兩種制劑進(jìn)行微生物限度檢查方法驗(yàn)證時(shí)，嘗試了不添加乳化劑進(jìn)行樣品的稀釋處理，而是用45 ℃保溫溶解，簡(jiǎn)化操作步驟，同時(shí)也避免了乳化劑對(duì)試驗(yàn)菌的干擾，實(shí)驗(yàn)結(jié)果滿意，現(xiàn)報(bào)道如下。

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辛芷滴鼻液，規(guī)格：10mL/支，批號(hào)：20190702、20190806、20190904;燒燙寧膏，規(guī)格：20 g/支，批號(hào)：20190507、20190616、20191010;均由酒鋼醫(yī)院制劑室生產(chǎn)。

pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液（稀釋液）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）、溴代十六烷三甲銨平板（CA）、甘露醇氯化鈉瓊脂平板（MSA），麥康凱液體和瓊脂培養(yǎng)基，均來(lái)源于青島海博。其他試劑均為分析純或化學(xué)純。

金黃色葡萄球菌[CMCC（B） 26003]（菌J）、銅綠假單胞菌[CMCC （B） 44104]（菌T）、枯草芽孢桿菌[CMCC（B） 63501]（菌K）、白色念珠菌[CMCC（F） 98001]（菌B）和黑曲霉[CMCC（F）98003]（菌H）、大腸埃希菌[CMCC（B） 44102]（菌D）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。以上菌株傳代次數(shù)不超過(guò)5代。

電子天平（YP5002，上海佑科）、壓力蒸汽滅菌器（上海三申）、細(xì)菌培養(yǎng)箱（LRH-80F，上海）、霉菌培養(yǎng)箱（MJX-80S，上海）恒溫水浴鍋、超凈工作臺(tái)（上海）、生物安全柜（BIOsafe12，上海力申）等。

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接種菌J、菌K、菌T的新培養(yǎng)體至TSB中，培育18～24h，用稀釋液配成每lmL含5000?10000cfu、500?1000cfu、50?100cfu的菌懸液：接種菌B的新培養(yǎng)體至SDB中，培育24～48h，用0.9%等滲無(wú)菌鹽水配成lml含5000-10000cfu， 500?1000cfu、50?100cfu的菌懸液。接種菌H的新培養(yǎng)體至SDB中，培育5?7d，加入3-5ml?0.9%等滲無(wú)菌鹽水，洗掉孢子后，緩緩吸取帶孢子的懸液（使用無(wú)菌紗布濾過(guò)菌絲）至無(wú)菌試管內(nèi)，用0.9%無(wú)菌氣化鈉諮液稀釋制成每1mL含孢子數(shù)5000?10000cfu、500～1000cfu， 50?100cfu的孢子懸液。各菌種、菌懸液均不過(guò)5代。

辛芷滴鼻液：取辛芷滴鼻液10mL至無(wú)菌容器中，傾入45 ℃的稀釋液至100mL，溶解，混勻，制成1：10供試液。

燒燙寧膏：取燒燙寧膏10 g至無(wú)菌容器中，傾入45℃的稀釋液至100mL，溶解，混勻，制成1：10供試液。

（1）試驗(yàn)組：取“2.2”下的供試液9.9 mL，加入菌J的菌液0.1mL，混勻，使l mL含菌量不超過(guò)100 cfu，吸取1ml加到無(wú)菌平皿中，隨即注入TSA。同法制備含菌K、菌T、菌B、菌H的供試液，各取1 mL同菌J操作。另外各取含菌B和菌H的供試液1 mL加到潔凈平皿中，隨即注入SDA。每種試驗(yàn)菌株各平行制備2個(gè)平皿。?。

（2）供試品對(duì)照組：取1：10的樣品溶液，用緩沖液替代菌液同試驗(yàn)組同法操作。

（3）菌液對(duì)照組：取稀釋液替代供試液，同試驗(yàn)組試驗(yàn)，添加各試驗(yàn)菌。

（4）陰性對(duì)照組：用同批配制、滅菌的TSB 1ml替代供試品溶液，同試驗(yàn)組進(jìn)行操作。

驗(yàn)證試驗(yàn)分3次獨(dú)立完成，各試驗(yàn)組分別采用上述供試品平行做3次。

各菌落計(jì)數(shù)方法按下式計(jì)算，回收率（R）=（試驗(yàn)組平均菌數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌數(shù)）/菌液對(duì)照組平均菌數(shù)。若0.5≤R≤2，則該法可行。若任何一次試驗(yàn)中R<0.5，則該法不適宜。

辛芷滴鼻液與燒燙寧膏試驗(yàn)結(jié)果均為R>0.5，說(shuō)明該方法可行。試驗(yàn)結(jié)果見表1、表2。

取“2.2”下的辛芷滴鼻液、燒燙寧膏1：10供試品溶液一次進(jìn)行菌J、菌T及菌D的方法適用性檢查，結(jié)果按常規(guī)法可以檢出試驗(yàn)菌相應(yīng)反應(yīng)特征。

辛芷滴鼻液和燒燙寧膏是酒鋼醫(yī)院根據(jù)臨床需求研制的醫(yī)院制劑，在臨床應(yīng)用中發(fā)揮了積極作用。由于這兩種制劑都含有中藥成分，辛芷滴鼻液中含有辛夷、白芷等四味中藥;燒燙寧膏則含有紫草，黃芩等5味中藥。根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》的要求，所有制劑均應(yīng)進(jìn)行微生物限度的檢查，查閱各文獻(xiàn)，研究我院制劑微生物限度檢查方法對(duì)保證制劑質(zhì)量意義重大。中藥原料來(lái)源多樣，微生物污染情況復(fù)雜且不易控制，而且有些中藥本身又有不同的抑菌性，若不進(jìn)行方法驗(yàn)證，將會(huì)導(dǎo)致微生物限度檢查結(jié)果不實(shí)。所以，驗(yàn)證確定適宜的微生物限度檢查方法，將有效提高醫(yī)院制劑的安全性和有效性。而本法的驗(yàn)證結(jié)果表明辛芷滴鼻液和燒燙寧膏中所含的中藥成分均對(duì)試驗(yàn)菌沒有抑制作用。

2015版《中國(guó)藥典》對(duì)油脂類供試品的處理方法是取供試品，添加滅菌的十四烷酸異丙酯，或少量無(wú)抑菌性的乳化劑、表面活性劑促溶解。這些都是化學(xué)方法促溶，有潛在的干擾性，本實(shí)驗(yàn)中的兩種制劑均為油脂類，在對(duì)供試品溶液制備過(guò)程中，筆者使用了水浴45℃加溫的物理方法促使供試品溶解，充分混勻，沒有加乳化劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各菌回收率均在0.5～2，即用45 ℃水浴加溫溶解油脂性供試品可行，此方法較加入助溶劑更易操作，步驟簡(jiǎn)單，更有利于日常的檢驗(yàn)操作，同時(shí)也避免了添加劑的干擾因素，本法的驗(yàn)證結(jié)果也為在微生物限度檢查過(guò)程中如何處理油性供試品提供了一種新的思路。尋找簡(jiǎn)單有效且符合藥典要求的處理方法是很有必要的。

2015版《中國(guó)藥典》對(duì)鼻用制劑控制菌的限度要求除了不得檢出菌J和菌T之外，還不得檢出菌D，本文也針對(duì)控制菌做了方法驗(yàn)證，均能按常規(guī)方法檢驗(yàn)。

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