邢曉瑩，于迪，喬羽，范振宇，王如福*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 晉中 030801；2.太原師范學(xué)院 生物系，山西 晉中 030619; 3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801)

山楂(CrataeguspinnatifidaBge.)，又名紅果、山里紅，為薔薇科(Rosaceace)山楂屬(CrataegusL.)植物。根據(jù)中醫(yī)理論山楂是一種食味酸甘的水果，富含VC、糖類、多種有機(jī)酸、色素(包括花青素、類黃酮和酚類物質(zhì)等)等營養(yǎng)成分[1]，具有藥食同源性。花青素作為一種抗氧化劑，可以降低血脂、炎癥及癌癥發(fā)病率[2-4]。山楂中的總黃酮類成分可促使心血管擴(kuò)張，冠狀動(dòng)脈血流量增加，產(chǎn)生降血壓作用。人們的消費(fèi)觀念正逐漸由傳統(tǒng)的山楂片、山楂糕向山楂果飲、山楂果醋轉(zhuǎn)變，而山楂果醋通過發(fā)酵加工不僅保持了山楂原有的果香氣味和營養(yǎng)價(jià)值，而且擁有鮮艷的色澤及食醋的保健功能，受到消費(fèi)者的喜愛[5]。

發(fā)酵食品獨(dú)特的風(fēng)味與參與其發(fā)酵的微生物群落密不可分[6]，目前現(xiàn)有的發(fā)酵型山楂醋多為自然發(fā)酵和人工接種發(fā)酵。自然發(fā)酵是不添加發(fā)酵劑，直接利用空氣中及水果表面攜帶的菌種進(jìn)行發(fā)酵，此方式操作簡(jiǎn)便，但發(fā)酵周期長(zhǎng)、效率低、過程不易控制，難以滿足人們的需求。人工接種發(fā)酵可縮短發(fā)酵周期，不受雜菌污染，但接種的菌種多為單一醋酸菌菌株，制成的山楂醋口感單一。頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜(HS-SPME/GC-MS)聯(lián)用技術(shù)因操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于椪柑、山楂、海棠果、砂梨等果醋揮發(fā)性香氣成分的分析中，提供了一定的理論基礎(chǔ)[7-10]。

多菌種發(fā)酵不僅能在一定程度上提高原料的利用率，還能縮短發(fā)酵周期，改善產(chǎn)品的營養(yǎng)品質(zhì)。近幾年，有研究混合菌種發(fā)酵蘋果醋、桑葚果醋、柿果醋的報(bào)道[11-13]，但應(yīng)用于發(fā)酵山楂果醋目前鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)利用從山西老陳醋中分離得到的酵母菌、醋酸菌和乳酸菌，采用混合菌種發(fā)酵技術(shù)對(duì)山楂進(jìn)行深加工，開發(fā)與研制山楂果醋，并測(cè)定了醋樣的揮發(fā)性香氣物質(zhì)，以期為山楂果醋的香氣特征研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂：產(chǎn)自山西省果樹研究所，采摘當(dāng)天運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室，分選、清洗備用；高活性干酵母：安琪酵母有限公司產(chǎn)品；醋酸菌(中科AS1.41)：中國普通微生物菌種保藏管理中心；乙醇假絲酵母(申請(qǐng)專利，保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心)、巴氏醋桿菌和戊糖片球菌：均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院山西老陳醋研究室提供。

果膠酶、蘆丁、抗壞血酸、偏重亞硫酸鉀：均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?；蔗糖：市售?/p>

1.2 儀器和設(shè)備

DS-1實(shí)驗(yàn)室組織搗碎機(jī) 上海昂尼儀器儀表有限公司；STARER 3100酸度計(jì) 上海奧豪斯儀器有限公司；DL-CJ-1ND無菌超凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器設(shè)備有限公司；TRACE-ISQ型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)儀 賽默飛世爾科技有限公司；VF-5MS型色譜柱、Varian 8400型固相微萃取進(jìn)樣器、75 μm聚二甲基硅氧烷萃取纖維頭、20 mL頂空進(jìn)樣瓶 美國Supelco公司；發(fā)酵罐(自制)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 山楂果醋的釀造工藝

山楂→去核→打漿→酶解→調(diào)糖與pH→巴氏殺菌→酒化→醋化→過濾→調(diào)配→灌裝→巴氏滅菌→檢測(cè)→成品。

1.3.2 操作要點(diǎn)1.3.2.1 山楂打漿及酶解處理

選擇新鮮無病的成熟山楂，用清水清洗干凈，去核后，稱重5 kg，按照山楂質(zhì)量比1∶3加水，加入0.01%的偏重亞硫酸鉀和0.1%的抗壞血酸組成的復(fù)合護(hù)色液。將山楂汁攪拌均勻，80 ℃滅菌20 min。冷卻至室溫后轉(zhuǎn)入20 L的發(fā)酵罐中，加入果膠酶，酶制劑用量為果漿質(zhì)量的0.1%～0.15%，即5～7.5 g，溫度25～30 ℃，攪拌均勻，靜置8～10 h。

1.3.2.2 調(diào)整糖度和pH值

將蔗糖熔化成的糖漿煮沸殺菌后加入果漿中，使糖度達(dá)到14 °Bx，根據(jù)酵母菌發(fā)酵要求，用NaOH溶液調(diào)整 pH 值至3.5～4.5。

1.3.2.3 酒化

取100 mL溫水(35～40 ℃)，加入安琪酵母攪拌至溶解。將活化后的乙醇假絲酵母和安琪酵母按2%和1%的比例接種于處理好的山楂汁中混合均勻，用4層干凈的紗布封口發(fā)酵24 h。前2 d有氧發(fā)酵，期間攪拌2～3次，之后的13 d封口進(jìn)行無氧發(fā)酵。

1.3.2.4 醋化[14]

將上述發(fā)酵液過濾，均分，取其中6份，分別接種中科AS1.41(10%)或山西老陳醋醋醅中分離的巴氏醋桿菌(5%)和戊糖片球菌(5%)，每組3個(gè)重復(fù)，發(fā)酵時(shí)間5～8 d。另取3份過濾后的發(fā)酵液，準(zhǔn)備麩皮、谷糠、稻殼，和原料按1∶0.9∶0.5∶0.2的比例混合。向酒精發(fā)酵液中緩慢加入輔料，混勻后按10%的接種量接種山西老陳醋種醅，發(fā)酵9 d，期間每天倒缸一次。發(fā)酵結(jié)束后，按1∶3加水淋醋。試驗(yàn)所用的發(fā)酵容器、紗布、恒溫振蕩培養(yǎng)箱等在使用前均已進(jìn)行徹底殺菌處理。恒溫振蕩培養(yǎng)箱的搖床轉(zhuǎn)速固定為150 r/min。

1.3.2.5 調(diào)配

發(fā)酵完成后，過濾得到澄清液，用蜂蜜、山楂果汁、蔗糖調(diào)制成口感良好、風(fēng)味獨(dú)特的山楂果醋。

1.3.2.6 過濾、殺菌、灌裝

調(diào)配好的山楂經(jīng)0.02 μm的濾芯除菌過濾，在60～70 ℃下加熱15～20 min進(jìn)行巴氏殺菌，最后靜置陳釀一段時(shí)間，經(jīng)檢驗(yàn)合格進(jìn)行無菌灌裝。

1.3.3 理化指標(biāo)分析

還原糖的測(cè)定：參照GB/T 15038-2006中的斐林試劑滴定法；總酸的測(cè)定：參照GB/T 15038-2006中的酸堿滴定指示劑法；黃酮的測(cè)定：參照滕曉弘的試驗(yàn)方法；酒精度的測(cè)定：采用蒸餾法。

1.3.4 樣品預(yù)處理及SPME-GC-MS聯(lián)用分析條件

采樣前先將萃取頭插入GC-MS的進(jìn)樣口中，于250 ℃老化并進(jìn)行空白試驗(yàn)，直至無色譜峰出現(xiàn)。準(zhǔn)確移取6.0 mL經(jīng)濾膜過濾后的山楂醋樣置于20 mL頂空瓶中，再按0.20 g/mL的質(zhì)量濃度加入NaCl溶解，加蓋密封。將進(jìn)樣瓶放入孵化爐，孵化爐攪拌速度100 r/min，孵化溫度為45 ℃保持10 min。將老化的SPME萃取頭插入頂空瓶中，使之與液面保持1.5 cm的距離，推出萃取頭，頂空吸附40 min。萃取后直接進(jìn)樣，在進(jìn)樣口溫度250 ℃解吸5 min。

色譜條件：VF-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 mm)；載氣為氦氣(He)；流速：1 mL/min；分流比5∶1；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；程序升溫：起始溫度40 ℃保持8 min，以4 ℃/min升至150 ℃，保持5 min，再以8 ℃/min的速度升至240 ℃保持10 min。質(zhì)譜條件：電子電離源(electron ionization，EI)；接口溫度280 ℃，離子源溫度250 ℃，溶劑延遲時(shí)間1.5 min，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍43～500 amu。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

檢索譜庫為Willey譜庫和美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院(national institute of standards and technology，NIST)譜庫，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)及化學(xué)成分的保留時(shí)間、質(zhì)譜圖譜和匹配度>80%等進(jìn)行定性分析。采用峰面積歸一化法進(jìn)行簡(jiǎn)單定量，求得各揮發(fā)性成分的相對(duì)含量。試驗(yàn)其他數(shù)據(jù)采用Excel 2003數(shù)學(xué)軟件和SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒化階段還原糖、酒精度的變化情況

酒化發(fā)酵前期會(huì)有大量泡沫產(chǎn)生。有研究表明[15-16]，發(fā)酵溫度在28～36 ℃范圍內(nèi)對(duì)酒精產(chǎn)量影響不大。較低的發(fā)酵溫度不僅有利于風(fēng)味物質(zhì)的形成，還降低了發(fā)酵過程中污染雜菌的幾率，因此酒化發(fā)酵溫度設(shè)置為28 ℃。

圖1 酒化過程中還原糖和酒精度變化情況Fig.1 The changes of reducing sugar and alcoholic strength during alcoholization fermentation

由圖1可知，隨著酵母菌的增殖代謝，發(fā)酵液酒精度呈不斷上升的趨勢(shì)，而還原糖含量逐漸下降。酒化前2 d是有氧發(fā)酵，酵母菌處于增殖時(shí)期，發(fā)酵液中的酒精含量較少；從第3天開始進(jìn)入主發(fā)酵期，醪液中糖分迅速下降，酒精含量不斷積累；從第13天開始至發(fā)酵結(jié)束，酒精度和還原糖含量的變化趨于平緩，此時(shí)基本發(fā)酵完全。酒化結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液的酒精度為8.3%，之后按照工藝流程接種醋酸菌、乳酸菌或醋醅進(jìn)行醋酸發(fā)酵。

2.2 醋化發(fā)酵液(醋醅)理化指標(biāo)的測(cè)定與分析

靜置發(fā)酵溫度設(shè)置為25 ℃和30 ℃，搖床(恒溫振蕩培養(yǎng)箱)發(fā)酵的溫度控制在30 ℃，發(fā)酵時(shí)間6 d。醋酸發(fā)酵是有氧發(fā)酵，在搖床發(fā)酵條件下，菌種與發(fā)酵液、氧氣充分接觸，迅速增殖并積累大量代謝產(chǎn)物。

圖2 AS1.41單一菌種醋化發(fā)酵結(jié)束時(shí)各指標(biāo)的含量Fig.2 The content of each index at the end of acetification fermentation with single AS1.41

由圖2可知，采用AS1.41純菌種進(jìn)行醋酸發(fā)酵時(shí)，總酸、不揮發(fā)酸及氨基酸態(tài)氮在搖床條件下的含量遠(yuǎn)高于其他兩種發(fā)酵條件，同時(shí)搖床發(fā)酵液中的還原糖含量最低。靜置條件下，緩慢進(jìn)行醋酸發(fā)酵的山楂醋比搖床發(fā)酵的樣品含有更多的酯類，為1.69 g/dL。氨基酸態(tài)氮的增長(zhǎng)來源于微生物對(duì)原料中蛋白質(zhì)的水解。由于氨基酸是兩性物質(zhì)，是很好的天然緩沖鹽，其含量的增加可以增強(qiáng)發(fā)酵體系的緩沖能力，利于穩(wěn)定體系的pH值，使發(fā)酵順利進(jìn)行。

接種混合菌種進(jìn)行醋酸發(fā)酵，待發(fā)酵結(jié)束時(shí)對(duì)其進(jìn)行各理化指標(biāo)的測(cè)定，見圖3。

圖3 混合菌種(巴氏醋桿菌、戊糖片球菌)醋化發(fā)酵結(jié)束時(shí)各指標(biāo)的含量Fig.3 The content of each index at the end of acetification fermentation with Acetobacter pasteurianus and Pediococcus pentosaceus

由圖3可知，搖床條件下混菌發(fā)酵液的總酸最高，為4.29 g/dL，略低于純菌種發(fā)酵，但混菌發(fā)酵液的不揮發(fā)酸和總酯含量卻高于純菌種發(fā)酵。搖床發(fā)酵條件下，混菌發(fā)酵液的不揮發(fā)酸比AS1.41發(fā)酵液的提高了0.16 g/dL；靜置發(fā)酵條件下，混菌發(fā)酵液的總酯含量比純菌種發(fā)酵液的提高了16.57%。接種乳酸菌在增加山楂果醋的不揮發(fā)酸含量的同時(shí)，其發(fā)酵糖類產(chǎn)生的乳酸與琥珀酸、檸檬酸等有機(jī)酸及各種酯類物質(zhì)還能緩解因乙酸含量高而導(dǎo)致的刺激酸味，使果醋酸味柔和、醇厚。在乳酸菌和醋酸菌的共同作用下，發(fā)酵液的殘?zhí)橇枯^低，說明混菌發(fā)酵比純菌種發(fā)酵能提高原料的利用率。

圖4 醋醅固態(tài)發(fā)酵結(jié)束時(shí)各指標(biāo)的含量Fig.4 The content of each index at the end of solid-stated fermentation with fermented grains

在固態(tài)發(fā)酵結(jié)束時(shí)，對(duì)醋醅取樣進(jìn)行理化指標(biāo)測(cè)定。由圖4可知，醋化完成后，醋醅的總酸、不揮發(fā)酸、總酯含量均高于純種發(fā)酵及混菌發(fā)酵，分別為5.26，0.82，2.39 g/100 g。完成酒化過程的發(fā)酵液在制醅時(shí)拌入大量的麩皮、谷糠、稻殼等，輔料的加入不僅提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也帶入了大量的微生物及酶系，它們與空氣中和種醅中的微生物互生、拮抗，共同完成醋化與酯化過程。在醋醅發(fā)酵過程中，主要的菌群是醋酸菌、乳酸菌、芽孢桿菌等細(xì)菌，真菌的數(shù)量較少，所有菌群隨著發(fā)酵過程的推進(jìn)均逐漸進(jìn)入殘留期。產(chǎn)酸菌代謝產(chǎn)生乙酸、乳酸、檸檬酸等酸類物質(zhì)及其他次生代謝產(chǎn)物，芽孢桿菌產(chǎn)生的高活性的蛋白酶、淀粉酶，從而將蛋白質(zhì)、淀粉等大分子物質(zhì)水解成氨基酸、葡萄糖、糊精、麥芽糖等產(chǎn)物。同時(shí)酸和醇在酯化酶的作用下結(jié)合生成酯。固態(tài)醋醅的環(huán)境有利于酯類化合物的形成[17]，醋醅的含水量約為60%，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)且反應(yīng)較完全，故而酯類物質(zhì)形成較多。代謝產(chǎn)物的種類在此發(fā)酵體系中比較豐富，產(chǎn)物之間又相互轉(zhuǎn)化、補(bǔ)充，共同構(gòu)成產(chǎn)品獨(dú)特的風(fēng)味。

2.3 頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(SPME-GC-MS)分析結(jié)果

采用頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(SPME-GC-MS)對(duì)3種山楂果醋樣本的香氣成分進(jìn)行分析，總離子流色譜圖見圖5。

圖5 山楂醋香氣成分總離子流色譜圖 Fig.5 Total ion chromatograms (TIC) of aroma components of hawthorn fruit vinegar analyzed by GC-MS

各組分質(zhì)譜分析結(jié)果中揮發(fā)性成分及各物質(zhì)百分含量見表1。

表1 山楂果醋的揮發(fā)性成分分析結(jié)果Table 1 The SPME-GC-MS analysis results of volatile components of hawthorn fruit vinegar

續(xù) 表

AS1.41發(fā)酵的果醋中共鑒定出30種揮發(fā)性香氣成分，其中酸類9種，占易揮發(fā)成分總量的37.56%；醇類5種，占總峰面積的16.12%；酯類8種，占總峰面積的30.16%；醛類4種，占總峰面積的4.86%；酮類1種，占總峰面積的0.06%；酚類1種，占總峰面積的0.29%，其他化合物占總峰面積的2.26%?；炀l(fā)酵的果醋中揮發(fā)性香氣成分經(jīng)質(zhì)譜分析出43種物質(zhì)，其中酸類10種，相對(duì)含量為33.46%；醇類9種，相對(duì)含量為16.48%；酯類11種，相對(duì)含量為37.71%；醛類5種，相對(duì)含量為6.19%；酮類1種，相對(duì)含量為0.06%；酚類1種，相對(duì)含量為0.36%，其他化合物的相對(duì)含量為3.40%。接種醋醅發(fā)酵的山楂果醋中揮發(fā)性香氣成分經(jīng)質(zhì)譜分析出52種物質(zhì)，其中酸類11種，相對(duì)含量為32.97%；醇類11種，相對(duì)含量為18.16%；酯類12種，相對(duì)含量為39.87%；醛類6種，相對(duì)含量為6.41%；酮類2種，相對(duì)含量為0.25%；酚類2種，相對(duì)含量為0.42%，其他化合物的相對(duì)含量為3.57%。

2.4 山楂果醋香氣成分分類分析

酸味是果醋成品中最突出的成分，直接影響產(chǎn)品的風(fēng)味和品質(zhì)。由表1可知，乙酸、5-氨基頡草酸、3-羥基丁酸、己酸在3種山楂果醋揮發(fā)性成分中均存在，而且在酸類物質(zhì)中占較高的含量；其他酸類物質(zhì)如正戊酸、丁酸、異丁酸、2-甲基丁酸、辛酸，也是3種山楂果醋中所共有的，其含量相對(duì)較低。己酸具有干酪味、少許的酸臭味，辛酸具有奶酪味、少許澀味，而3-羥基丁酸、異丁酸等則略帶刺激性氣味。低濃度的酸會(huì)賦予果醋清淡的、令人愉快的香味，但濃度過高時(shí)會(huì)對(duì)果醋香氣品質(zhì)產(chǎn)生消極的影響。4-甲基-2-氧戊酸在混菌發(fā)酵和醋醅中被檢測(cè)到；異戊酸僅存在于醋醅中，但其含量很低，僅0.08%。酸類物質(zhì)大多具有較為強(qiáng)烈的刺激性口感，山楂果醋中酸類物質(zhì)的種類及其含量，對(duì)產(chǎn)品香味的貢獻(xiàn)程度遠(yuǎn)不如其對(duì)果醋口感的影響大。

醋醅發(fā)酵的山楂果醋樣本中共檢測(cè)到11 種醇類化合物，分別是乙醇、異戊醇、1-戊醇、絲氨醇、桉葉油醇、芳樟醇、苯乙醇、1-甲基-4-(1-甲基乙基)-3-環(huán)己烯-1-醇、1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)環(huán)己醇、2-(4-甲基苯基)丙-2-醇、松油醇。乙醇在3種山楂果醋樣本中的相對(duì)含量均為最高，其次是異戊醇。乙醇是山楂汁經(jīng)酒精發(fā)酵產(chǎn)生的主要醇類化合物，作為醋酸發(fā)酵過程中的底物，發(fā)酵結(jié)束后有一定的殘留。此外，芳樟醇具有鈴蘭香氣；苯乙醇是一種芳香烴的衍生物，具有清甜的玫瑰花香、新鮮面包香味；松油醇具有紫丁香味道，與乙醇一樣，同時(shí)也存在于山楂汁中。醇類物質(zhì)主要是在酒化階段經(jīng)酵母菌代謝產(chǎn)生或在蛋白質(zhì)水解過程中由氨基酸脫羧形成的，在山楂果醋的揮發(fā)性成分中占16%～19%左右。醇類物質(zhì)的存在主要是增加果醋圓潤(rùn)的口感，而在香氣特征方面的貢獻(xiàn)較酯類物質(zhì)要小。

豐富多樣的酯類物質(zhì)賦予果醋果香或花香的感官特性，是評(píng)價(jià)果醋品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。固態(tài)醋醅發(fā)酵的山楂果醋共鑒定出12種酯類化合物，是3種發(fā)酵果醋中酯類物質(zhì)種類最多的一種。乙酸乙酯的相對(duì)含量最高，具有很強(qiáng)的酯香和果香，對(duì)山楂果醋的特征香氣具有較大的貢獻(xiàn)；乳酸乙酯和苯甲酸乙酯的相對(duì)含量?jī)H次于乙酸乙酯。此外，苯甲酸乙酯有強(qiáng)的冬青油和水果香氣，可用于食用香精中；乙酸異戊酯具有較強(qiáng)的類似蘋果的香味；乙酸苯乙酯可用于配制玫瑰香精；辛酸乙酯具有白蘭地香型香氣，用于配制食用香精?；炀l(fā)酵和醋醅發(fā)酵的樣品中，酯類在揮發(fā)性物質(zhì)中的相對(duì)含量均為最高，且其本身屬于揮發(fā)性強(qiáng)、氣味強(qiáng)烈的物質(zhì)，因此酯類物質(zhì)很有可能是構(gòu)成果醋香氣特征風(fēng)味的主導(dǎo)成分。

通過SPME-GC-MS分析，其原因很可能與醋化過程中形成的產(chǎn)物種類與相對(duì)含量的不同有關(guān)，某些組分通常具有獨(dú)特的香味或能夠輔助其他物質(zhì)發(fā)揮出香氣，從而影響了最終產(chǎn)品在風(fēng)味品質(zhì)上的差別。除酸類、酯類、醇類這些主要化合物外，山楂果醋中還含有一些酚類、醛類、酮類等物質(zhì)，如3-羥基-2-丁酮(乙偶姻)最初形成于醋化階段，是四甲基吡嗪(川芎嗪)的前體物質(zhì)；苯甲醛具有苦杏仁、櫻桃及堅(jiān)果香，可用于香料合成；壬醛具有玫瑰花香；丁香酚具有降血壓、防腐殺菌的功效，可以延長(zhǎng)山楂醋的保質(zhì)期；同時(shí)茶香螺烷、丁香酚、1,4-桉葉素等成分都可以當(dāng)食用香料使用。雖然這些物質(zhì)相對(duì)含量較低，卻極具香氣特征，在一定程度上增加或賦予了山楂果醋的水果或花香味。

2.5 不同發(fā)酵方式對(duì)山楂果醋中總黃酮含量的影響

由表2可知，30 ℃搖床發(fā)酵條件下的發(fā)酵液，總黃酮的含量總體大于其他兩種發(fā)酵條件下的發(fā)酵液，接種醋醅樣品中的總黃酮含量最高，達(dá)0.823 mg/mL；其次為混菌發(fā)酵的樣品，為0.705 mg/mL。

表2 醋酸發(fā)酵結(jié)束時(shí)總黃酮的含量Table 2 The content of total flavonoids at the end of acetic acid fermentation

3 討論

AS1.41為惡臭醋桿菌，生成醋酸的最適溫度為28～33 ℃，最高產(chǎn)醋酸量為6%～9%，因其能氧化分解醋酸為CO2和H2O[18-20]，所以醋化結(jié)束后要及時(shí)終止發(fā)酵，否則容易發(fā)生過氧化作用，導(dǎo)致成品醋的總酸含量降低。巴氏醋酸桿菌由于醋酸和酯類的轉(zhuǎn)化率高，所以制得的果醋在感官上要好于采用惡臭醋桿菌發(fā)酵的果醋。接種巴氏醋桿菌和戊糖片球菌或醋醅，經(jīng)發(fā)酵制取的山楂果醋無論是理化測(cè)定結(jié)果，還是物質(zhì)利用率、產(chǎn)物生成量或種類，相比純菌種發(fā)酵都有明顯提高，豐富了山楂果醋的風(fēng)味。

不同菌種發(fā)酵的果醋樣本在感官品質(zhì)上的差異主要體現(xiàn)在果醋的香氣和口感上[21]，本試驗(yàn)接種不同菌種發(fā)酵的山楂果醋在風(fēng)味品質(zhì)方面也有較明顯的區(qū)別，與韓瑨烜的試驗(yàn)結(jié)果相一致。3種山楂果醋樣本經(jīng)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，純菌株發(fā)酵液中含量最高的是酸類物質(zhì)，其次是酯類和醇類物質(zhì)；混菌發(fā)酵、接種醋醅的樣品中酯類物質(zhì)的含量最高，酸類物質(zhì)含量次之，之后是醇類物質(zhì)。初步確定酸類化合物、醇類化合物、酯類化合物和醛類化合物相對(duì)含量較高，是構(gòu)成山楂果醋香氣的主體成分。

乳酸菌對(duì)葡萄糖等碳源進(jìn)行同型發(fā)酵和異型發(fā)酵時(shí)，除了產(chǎn)生大量的乳酸、乙酸外，還產(chǎn)生少量的甲酸、丙酸等其他酸性末端產(chǎn)物。酒化階段，乙醇假絲酵母的加入在一定程度上會(huì)促進(jìn)乳酸菌的增殖[22]。乳酸乙酯具有天然的芳香氣味，對(duì)乙酸等刺激性酸味能起到很好的遮味效果，使山楂果醋成品的香味更加柔和。乳酸乙酯的產(chǎn)生是由多種微生物共同作用的結(jié)果，先由乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸和酵母菌代謝產(chǎn)生的乙醇來提供酯化的前體物質(zhì)，然后在丁酸菌等微生物提供的酯化酶作用下酯化生成。接種混菌和醋醅發(fā)酵的山楂果醋中，乳酸乙酯的含量要明顯高于純菌種發(fā)酵的樣本。山楂中含有豐富的原花青素，特別是低聚原花青素(OPCs)，它們作為主要的酚類化合物，多為表兒茶素，還有少量的兒茶素[23]。研究表明，當(dāng)在酸性條件下加熱時(shí)，原花青素會(huì)在分子花青素和分子表淀粉中發(fā)生水解，導(dǎo)致樣品顏色變深。而本試驗(yàn)選擇生料發(fā)酵法，制成的山楂醋色澤鮮艷，有效減緩了原花青素的降解。

與鮮山楂果肉中的揮發(fā)性成分相比[24]，經(jīng)發(fā)酵制得的山楂果醋中仍保留的成分有辛酸乙酯、α-松油醇、苯乙醇、苯甲醛和丁香酚，且這些物質(zhì)經(jīng)發(fā)酵后各物質(zhì)含量比鮮果肉中的增加了1.24～18.4倍不等，其中苯乙醇由原來的0.05%增加到0.97%，是增幅最大的物質(zhì)。一般的發(fā)酵產(chǎn)品經(jīng)過微生物的長(zhǎng)期發(fā)酵之后都會(huì)產(chǎn)生許多不同的副產(chǎn)物，山楂的品種、微生物種類及發(fā)酵方式的不同，也會(huì)引起最終山楂果醋的揮發(fā)性組成成分的差別。本試驗(yàn)釀制的山楂果醋與郝紅梅密封發(fā)酵90 d所得的山楂醋對(duì)比發(fā)現(xiàn)，二者的揮發(fā)性組分不盡相同，例如：5-氨基頡草酸、正戊酸、芳樟醇、月桂酸乙酯等；但是以山楂為原料釀制的果醋所含酯類物質(zhì)的相對(duì)含量均較高(30%～40%)，這可能是由于新鮮山楂果肉的酯類種類豐富且相對(duì)含量高(78.41%)的物種特性所致。

4 結(jié)論

綜上所述，從山西老陳醋分離得到的優(yōu)勢(shì)菌株可以適應(yīng)山楂果醋的釀制，且由戊糖片球菌和巴氏醋桿菌組成的混菌發(fā)酵優(yōu)于純菌種(中科AS1.41)發(fā)酵，其最佳發(fā)酵條件為：酒化的發(fā)酵條件為接種安琪果酒專用酵母和乙醇假絲酵母，發(fā)酵溫度25 ℃，前2 d敞口發(fā)酵，后13 d封口發(fā)酵；醋化的發(fā)酵條件為接種醋醅，接種量為10%(m/m)，發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時(shí)間為6 d，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，酸度達(dá)到6 g/dL，黃酮含量為0.823 mg/mL。

利用SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)不同菌種發(fā)酵的山楂果醋香氣成分進(jìn)行了鑒定，酸類、酯類、醇類、醛類和酚類化合物，總含量占總揮發(fā)性物質(zhì)的90%左右，其中乙酸乙酯、苯甲酸乙酯、乙酸、己酸、糠醛、苯甲醛、丁香酚等為香氣的主體成分。山楂果醋成品澄清透亮，酸味柔和，略帶甜味，保留了山楂果的清香和黃酮、丁香酚、松油醇等功能因子；山楂醋主體自然呈現(xiàn)的棕紅色澤，不需要額外添加人工色素，會(huì)受到越來越多消費(fèi)者的偏愛。