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        水楊酸處理誘導(dǎo)采后甜瓜抗壞血酸-還原型谷胱甘肽循環(huán)代謝清除過氧化氫的作用及機制

        2021-01-20 06:50:36范存斐任亞琳
        食品科學(xué) 2021年1期

        楊 乾,范存斐,王 毅,任亞琳,畢 陽

        (甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州 730070)

        化學(xué)誘抗劑可有效誘導(dǎo)厚皮甜瓜對多種采后真菌的抗性[1],其誘導(dǎo)抗性的機制與激活苯丙烷、活性氧和能量等代謝密切相關(guān)[2]。氧爆是誘抗劑處理果實后的典型反應(yīng)[3],氧爆初期產(chǎn)生的少量活性氧可作為信號分子激活相關(guān)防御反應(yīng),而后期產(chǎn)生的大量活性氧則具有直接抑菌、促進氧化交聯(lián)等作用[4]。然而,過量活性氧會破壞細胞膜結(jié)構(gòu)、降低果實的抗病性[5]。植物體內(nèi)已進化出有效的清除系統(tǒng)來平衡活性氧,以防止過量活性氧的傷害[6]。清除系統(tǒng)包括酶促和非酶促兩類,前者包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化物酶、過氧化氫酶(catalase,CAT)以及抗壞血酸(ascorbic acid,AsA)-還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)循環(huán)相關(guān)酶,后者包括VE、VC、谷胱甘肽、多酚和類黃酮等[7]。有研究表明,采后水楊酸處理柑桔[8-9]、苯并噻二唑(benzothiadiazole,BTH)處理蘋果[10]能誘導(dǎo)果實氧爆,同時提高其SOD活性,但會降低CAT活性。由此表明,誘抗劑所誘導(dǎo)的清除H2O2不依賴于過氧化氫酶。AsA-GSH循環(huán)是植物體內(nèi)存在的一個重要抗氧化保護系統(tǒng),主要通過GSH和AsA的氧化還原來清除H2O2,在維持H2O2產(chǎn)生和清除平衡中發(fā)揮了重要作用[11]。有研究表明,水楊酸及其類似物BTH處理能促進柑橘和蘋果AsA-GSH循環(huán)[9-10]。由此表明,AsA-GSH循環(huán)在誘抗劑激發(fā)的H2O2清除中具有重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),采后BTH處理會通過激發(fā)厚皮甜瓜的氧爆來提高果實的抗病性[12],但AsA-GSH循環(huán)如何系統(tǒng)參與誘抗劑激發(fā)的厚皮甜瓜H2O2清除鮮見報道。本研究以‘玉金香’厚皮甜瓜為試材,研究采后水楊酸(salicylic acid,SA)浸泡處理對果實活性氧的積累和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的影響,測定處理后果實的SOD和CAT活力,以及AsA-GSH循環(huán)代謝酶活性和產(chǎn)物含量。以期為揭示AsA-GSH循環(huán)在清除誘抗劑激發(fā)的果實過量H2O2方面提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        供試‘玉金香’甜瓜于2 0 1 0 年7 月采自甘肅省民勤縣收成鄉(xiāng)露地大田。選取大小一致、成熟度大約九成、單果質(zhì)量約0.5~0.7 kg、可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)約12%~13%、無損傷、無病蟲害的果實,單果套發(fā)泡網(wǎng)袋,入包裝箱(20 個/箱),第2天運抵甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)采后生物學(xué)與技術(shù)實驗室,于常溫((22±2)℃、相對濕度55%~60%)下貯藏待用。

        SA(分析純) 天津市光復(fù)精細化工研究所。

        1.2 儀器與設(shè)備

        3K30臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司;UV-2450紫外-可見光分光光度計 日本島津公司;DDS-307A電導(dǎo)率儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司;DW-HL218超低溫冰箱 中科美菱低溫科技有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 甜瓜處理

        甜瓜處理參照范存斐等[13]的方法。SA用少量體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液溶解后加蒸餾水配制成濃度為4 mmol/L的溶液(內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween-80,用1 g/100 mL NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0)。取甜瓜果實表面用自來水沖洗干凈后晾干,將晾干后的果實浸入4 mmol/L的SA溶液中10 min,取出晾干后,單果套發(fā)泡網(wǎng)袋,放入包裝箱(20 個/箱),于常溫((22±2)℃、相對濕度55%~60%)下貯藏待用。以清水(內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween-80,用1 g/100 mL NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0)處理作對照。每處理用果實40 個,重復(fù)3 次。

        參照Ren Yalin等[14]的方法取樣,分別于處理后0、2、4、6、8、10 d用直徑5 mm打孔器打取皮下3~10 mm處組織3 g,錫箔紙包好后液氮冷凍,在-80 ℃超低溫冰箱中保存待測。

        1.3.2 MDA含量的測定

        參照Hodges等[15]的方法測定MDA含量。取3 g冷凍組織,加5 mL 100 g/L三氯乙酸溶液研磨,研磨后的勻漿于4 ℃、12 000×g條件下離心20 min,取上清液,加入相應(yīng)試劑后,分別測定其在450、532 nm及600 nm波長處的吸光度,MDA含量單位為μmol/g。

        H2O2含量的測定參照Prochazkova等[16]的方法。取3 g冷凍組織,加入3 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的丙酮,冰浴條件下研磨成勻漿后,于4 ℃、12 000×g條件下離心20 min。取上清液,加入相應(yīng)試劑后測定其在410 nm波長處的吸光度。H2O2含量單位為mmol/g。

        1.3.4 SOD和CAT活力測定

        粗酶液的提取參照Lacan等[17]的方法并略作修改。取3 g冷凍組織,分別向研缽內(nèi)加入3 mL 0.1 mol/L p H 7.5 磷酸鹽緩沖液(含5 m m o/L 二硫蘇糖醇和2 g/100 mL PVP),在冰浴條件下研磨成勻漿后于4 ℃、12 000×g離心30 min,上清液即為粗酶液。

        SOD活力測定參照Oberley等[18]的方法并略作修改,測定反應(yīng)液在560 nm波長處吸光度。以每克組織抑制氮藍四唑光化還原的50%定義為一個酶活力單位(U),SOD活力單位為U/g。

        CAT活力測定參照Clairbone[19]的方法并略作修改,測定反應(yīng)液在240 nm波長處的吸光度。以每克組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化1 nmol H2O2降解定義為一個酶活力單位(U),CAT活力單位為U/g。

        1.3.5 AsA-GSH循環(huán)代謝酶活力的測定

        粗酶液的提取參照Nakano等[20]的方法。取3.0 g冷凍組織于預(yù)冷的研缽中,加5 mL預(yù)冷的50 mmol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液(含1 mmol/L抗壞血酸、1 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、2 g/100 mL PVP,0.25% TritonX-100)研磨,于4 ℃、16 000×g離心20 min,上清液即為粗酶液。

        抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)活力的測定參照Nakano等[20]的方法。取上清液加入相應(yīng)試劑后,測定其在290 nm波長處的吸光度。以每克組織每分鐘氧化1 μmol AsA定義為一個酶活力單位(U),APX活力單位為U/g。

        谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)活力的測定參照Halliwell等[21]的方法。取上清液,加入相應(yīng)試劑后測定其在340 nm波長處的吸光度。以每克組織每分鐘氧化1 μmol煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)定義為一個酶活力單位(U),GR活力單位為U/g。

        脫氫抗壞血酸還原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)活力的測定參照Nakano等[20]的方法并略作修改,取上清液,加入相應(yīng)試劑后測定其在265 nm波長處的吸光度。以每克組織每分鐘還原1 μmol AsA定義為一個酶活力單位(U),DHAR活力單位為U/g。

        單脫氫抗壞血酸還原酶(monodehydroascorbate reductase,MDHAR)的活力測定參照Nakano等[20]的方法并修改,取上清液,加入相應(yīng)試劑后測定其在340 nm波長處的吸光度。以每克組織每分鐘還原1 μmol NADPH定義為一個酶活力單位(U),MDHAR活力單位為U/g。

        1.3.6 AsA-GSH循環(huán)產(chǎn)物和底物含量的測定

        AsA、脫氫抗壞血酸(dehydroascorbate,DHA)含量測定參照Turcsányi等[22]的方法并略作修改。取3 g冷凍組織,加入5 mL 100 mmol/L鹽酸,冰浴條件下充分研磨,于4 ℃、7 800×g離心10 min,取上清液立即用于后續(xù)實驗。AsA含量的測定:取100 μL上清液加入2 mL 100 mmol/L磷酸鉀緩沖液,再加入0.5 mL蒸餾水,在265 nm波長處測其吸光度,AsA含量單位為μg/g。

        總抗壞血酸含量的測定:取100 μL上清液加入2 mL 100 mmol/L磷酸鉀緩沖液和0.5 mL 2 mmol/L二硫蘇糖醇溶液,置于室溫下反應(yīng)8 min后,在265 nm波長處測定其吸光度,總抗壞血酸含量單位為μg/g??偪箟难岷繙p去AsA含量即為DHA含量,DHA含量單位為μg/g。

        GSH和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)含量的測定參照Brehe等[23]的方法并略作修改。取3 g冷凍組織,加入5 mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)6%偏磷酸(pH 2.8),冰浴條件下研磨成勻漿,于4 ℃、12 500×g條件下離心20 min,所得上清液為粗酶液。

        總谷胱甘肽含量測定:500 μL上清液加入2.5 mL反應(yīng)液,其中反應(yīng)液包含800 μL反應(yīng)液1(110 mmol/L Na2HPO4·7H2O、40 mmol/L NaH2PO4·H2O、15 mmol/L EDTA、0.3 mmol/L二硫代二硝基苯甲酸、0.04 g/100 mL牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、8 0 0 μ L 反應(yīng)液2(1 m m o l/L E D TA、5 0 m m o l/L咪唑和0.0 2 g/1 0 0 m L B S A)、8 0 0 μ L 反應(yīng)液3(5 g/100 mL pH 7.5 Na2HPO4)和100 μL 9 mmol/L NADPH,以體積分?jǐn)?shù)6%偏磷酸(pH 2.8)代替粗酶液作為對照,測定反應(yīng)體系在412 nm波長處的吸光度,總谷胱甘肽含量單位為μg/g。

        GSSG及GSH含量測定:在500 μL粗酶液中共加入2.5 mL乙烯吡啶,25 ℃下水浴1 h,在412 nm波長處測定其吸光度,GSSG含量單位為μg/g。GSH的含量由總谷胱甘肽含量減去GSSG含量得到,單位為μg/g。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

        上述每項指標(biāo)測定至少重復(fù)3 次。用Excel 2010軟件計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差,用SPSS 19.0軟件進行Duncan's多重差異顯著性分析(P<0.05)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 SA處理對甜瓜果實貯藏過程中MDA含量的影響

        圖1 SA處理對甜瓜果實貯藏過程中MDA含量的影響Fig.1 Effect of SA treatment on MDA content in melons

        由圖1可知,SA處理組和對照組果實的MDA含量在貯藏期間逐漸升高,SA處理組果實的MDA含量在貯藏的中后期低于對照組,第10天時低于對照組14.6%(P<0.05)。說明SA處理可以抑制甜瓜貯藏期間MDA的產(chǎn)生,有利于維持細胞膜的完整性。

        2.2 SA處理對甜瓜果實貯藏過程O2-·產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響

        圖2 SA處理對厚皮甜瓜果實貯藏過程中·產(chǎn)生速率(A)和H2O2含量(B)的影響Fig.2 Effect of SA treatment on superoxide anion radial production rate (A) andH2O2 content (B) in melons

        2.3 SA處理對甜瓜果實貯藏過程SOD及CAT活力的影響

        貯藏期間,SA處理組和對照組果實的SOD活力均呈先下降后上升再下降的趨勢,SA處理組果實的SOD活力整體高于對照組,第6天較對照組高21.3%(P<0.05)(圖3A)。SA處理組和對照組果實的CAT活力在貯藏期間總體呈下降趨勢,且SA處理組果實的CAT活力明顯低于對照組,第4天較對照組低22.9%(P<0.05)(圖3B)。SOD和CAT活力的結(jié)果表明,SA處理提高了厚皮甜瓜果實的SOD活力,但抑制了CAT活力。

        圖3 SA處理對厚皮甜瓜果實貯藏過程中SOD(A)和CAT(B)活力的影響Fig.3 Effect of SA treatment on SOD (A) and CAT (B) activities in melons

        2.4 SA處理對甜瓜果實貯藏過程AsA-GSH循環(huán)代謝相關(guān)物質(zhì)含量和酶活力的影響

        貯藏期間,SA處理組果實的APX活力整體呈先上升后下降的趨勢,對照組果實的活力基本保持平穩(wěn),后期緩慢降低再升高。SA處理組果實的APX活力明顯高于對照組,第2天較對照組高2.6 倍(P<0.05)(圖4A)。SA處理組和對照組果實的MDHAR活力在貯藏期間呈先下降后上升的趨勢,SA處理組果實的活力明顯高于對照組,處理后第10天較對照組高70.8%(P<0.05)(圖4B)。SA處理組和對照組果實DHAR活力在貯藏期間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,處理組果實的活力明顯高于對照組,第6天時較對照組高67.8%(P<0.05)(圖4C)。SA處理組果實的GR活力在貯藏期間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,對照組果實的GR活力則緩慢上升并趨于平穩(wěn),SA處理組果實GR活力明顯高于對照組,處理后第4天較對照組高1.3 倍(P<0.05)(圖4D)。

        貯藏期間,SA處理組和對照組果實中AsA含量呈先下降后上升的趨勢,但SA處理組果實的AsA含量明顯高于對照組,第8天較對照組高1.4 倍(P<0.05)(圖4E)。SA處理組和對照組果實DHA含量在貯藏期間先上升后下降并趨于平穩(wěn),SA處理組果實的DHA含量明顯低于對照組,處理后第4天低于對照組64.2%(P<0.05)(圖4F)。對照組和SA處理組果實中GSSG含量在貯藏期間呈先下降后緩慢上升的趨勢,但SA處理組果實的GSSG含量明顯高于對照組,第8天高出對照組71.5%(P<0.05)(圖4G)。SA處理組果實的GSH含量在貯藏期間呈先上升后降低再升高的趨勢,對照組果實的GSH含量呈先上升后平穩(wěn)降低的趨勢,但SA處理組果實的GSH含量明顯低于對照組,處理后第8天低于同期對照組66.1%(P<0.05)(圖4H)。AsA-GSH循環(huán)中的4 種抗氧化酶(APX、MDHAR、DHAR和GR)與AsA、DHA、GSH和GSSG相互作用可以清除H2O2。上述結(jié)果表明,SA處理激活了厚皮甜瓜果實的AsA-GSH循環(huán),促進了H2O2的清除。

        圖4 SA處理對厚皮甜瓜果實貯藏過程中AsA-GSH循環(huán)代謝相關(guān)物質(zhì)含量和酶活力的影響Fig.4 Effect of SA treatment on substance contents and enzyme activities related to AsA-GSH cycle in melons

        3 討 論

        氧爆是SA及其類似物處理果實后的典型反應(yīng)[3],即產(chǎn)生大量的·和H2O2。氧爆期間,NADPH電子通過NADPH氧化酶(NADPH oxidases,NOX)轉(zhuǎn)移給O2,從而產(chǎn)生·[14],·很快在SOD作用下歧化為H2O2[7]。氧爆早期的少量H2O2可作為信號分子激活相關(guān)防御反應(yīng),而后期產(chǎn)生的大量H2O2則具有直接抑菌、促進氧化交聯(lián)等作用[24]。有研究表明,BTH處理可提高蘋果果實NOX和SOD活力,進而導(dǎo)致·和H2O2的積累[10],該結(jié)果與本研究水楊酸處理甜瓜后得到的結(jié)果基本一致。由于活性氧會提高脂氧合酶和磷脂酶D的活力,導(dǎo)致多不飽和脂肪酸的降解,從而增加脂質(zhì)飽和度,改變膜的流動性,形成MDA等脂質(zhì)過氧化物[25]。雖然本研究發(fā)現(xiàn)SA處理導(dǎo)致了厚皮甜瓜果實·和H2O2的顯著積累,但同時抑制了MDA產(chǎn)生。由此表明,SA處理還激活了厚皮甜瓜果實的抗氧化系統(tǒng),避免了過量活性氧對細胞膜的傷害。

        AsA-GSH循環(huán)是存在于植物體內(nèi)重要的H2O2清除系統(tǒng),在有效清除H2O2水平中發(fā)揮著重要作用[31]。在此循環(huán)中,APX分解H2O2形成H2O和單脫氫抗壞血酸(monodehydroascorbate,MDHA),MDHA可進一步轉(zhuǎn)化為DHA,DHAR可催化DHA向AsA轉(zhuǎn)變,AsA也可在MDHAR作用下轉(zhuǎn)變?yōu)镸DHA,同時,GSH在DHAR作用下轉(zhuǎn)變?yōu)镚SSG,GSSG經(jīng)GR和NADPH的作用還原為GSH[12](圖5)。APX是AsA-GSH循環(huán)中的第一個酶,能專一性地催化AsA與H2O2反應(yīng)形成MDHA[30]。GR是一種黃素蛋白氧化還原酶,能將谷胱甘肽二硫化物還原為巰基形式[7];也是重要的抗氧化酶,可保護酶蛋白的巰基,在NADPH的作用下能將GSSG轉(zhuǎn)化為GSH,進一步降低氧化應(yīng)激[32]。本研究發(fā)現(xiàn),SA處理能通過增強APX和GR活力來清除過量的H2O2,該結(jié)果與BTH增強草莓[5]和蘋果[10]果實APX和GR活力結(jié)果類似。MDHAR是一種黃素腺嘌呤二核苷酸酶,以葉綠體和細胞溶質(zhì)同工酶的形式存在。MDHAR可以協(xié)同APX清除H2O2[7]。DHAR是另一種重要的酶,在GSH和NADH存在的條件下催化DHA向AsA轉(zhuǎn)變[33]。本研究發(fā)現(xiàn)SA處理提高甜瓜DHAR和MDHAR活力的結(jié)果與SA處理蘿卜觀察到的結(jié)果[34]類似。AsA是植物組織普遍存在的重要抗氧化劑[31],可去除·OH、淬滅1O2、降低·產(chǎn)生速率,并催化H2O2分解為H2O和O2[35]。AsA可被APX氧化為MDHA,然后形成DHA,在MDAR和DHAR同時存在時,AsA可由MDHA和DHA再生[36]。此外,AsA再生也與GSH通過DHAR氧化為GSSG有關(guān)[36]。有研究表明,SA是植物應(yīng)對環(huán)境脅迫的重要調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì),SA處理可以提高植物組織AsA含量[36]。本研究發(fā)現(xiàn),SA處理明顯促進了厚皮甜瓜果實的AsA積累,抑制了DHA的生成,該結(jié)果與BTH處理增強蘋果果實AsA含量[10]和SA處理抑制柑橘果實DHA含量[9]的結(jié)果相似。谷胱甘肽是具有抗氧化功能的小分子短肽[9]。本研究發(fā)現(xiàn),SA處理會使厚皮甜瓜果實GSSG含量升高,GSH含量降低,可能是DHAR和GR活力的升高促使GSSG向GSH轉(zhuǎn)化。

        圖5 SA處理誘導(dǎo)采后甜瓜AsA-GSH循環(huán)代謝清除H2O2模式Fig.5 Scheme of AsA-GSH cycle participates in H2O2 scavenging in muskmelons induced by salicylic acid

        4 結(jié) 論

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