付 云，趙謀明,2，龐一揚(yáng)，劉小玲,*

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510000）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是食品中常見的食源性致病菌，廣泛分布于自然界中，容易污染乳制品、水產(chǎn)品和肉制品等食品，造成食物中毒，進(jìn)而威脅人類的生命健康安全[1]。因此，有效抑制食品中金黃色葡萄球菌的生長繁殖、提高食品安全性，是對(duì)人類健康和生命安全的重要保障。

抗菌肽是一類天然的具有抗細(xì)菌或真菌作用的小分子生物活性肽，因有望成為新型天然食品防腐劑而備受關(guān)注[2]。作為天然來源的抗菌肽，與傳統(tǒng)的抗菌劑相比，其獨(dú)特的抑制病原微生物生長且不易產(chǎn)生耐藥性的機(jī)理已成為廣大學(xué)者的研究熱點(diǎn)。Powers等[3]研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽polyphemusin可破壞大腸桿菌細(xì)胞膜，從而使菌體裂解死亡；陳飛龍等[4]研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽F1能夠以嵌插方式與金黃色葡萄球菌的DNA結(jié)合，干擾其正常代謝，從而達(dá)到抑菌效果。然而，由于抗菌肽生產(chǎn)成本高昂，且對(duì)其抑菌機(jī)理研究尚不夠深入，限制了其在食品及農(nóng)業(yè)生物防治等方面的應(yīng)用發(fā)展[5]。

螺旋藻渣是螺旋藻粉生產(chǎn)過程中的沉積物，其蛋白質(zhì)含量高、價(jià)格低廉。在本課題組前期研究中，采用枯草芽孢桿菌YA215發(fā)酵螺旋藻渣，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵產(chǎn)物具有顯著的抗金黃色葡萄球菌效果[6]，后續(xù)通過Sephadex LH-20凝膠層析柱和反相高效液相色譜法進(jìn)行分離純化，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜從發(fā)酵產(chǎn)物中鑒定得到兩種抗菌多肽：一種是伊枯草菌素（iturin A），分子質(zhì)量1 043.44 Da，為枯草芽孢桿菌自身代謝產(chǎn)物[7]；另一種是螺旋藻渣發(fā)酵過程中產(chǎn)生的新型抗菌肽，將其命名為SP-AP-1，分子質(zhì)量1 422.60 Da，氨基酸序列為ATHDNCCLRQS。兩種抗菌肽iturin A和SP-AP-1對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）分別為0.052 mg/mL和0.014 mg/mL，本實(shí)驗(yàn)以金黃色葡萄球菌為指示菌，從細(xì)胞膜表面疏水性、細(xì)胞膜通透性、K+泄漏情況、蛋白質(zhì)合成和基因組DNA遷移變化等方面探究兩種抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)理，并比較其抗菌效果，以期為抗菌肽iturin A和SP-AP-1在食品和藥品領(lǐng)域中的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

金黃色葡萄球菌CGMCC 14519由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供。

抗菌肽SP-AP-1（純度＞95%）由湖北普羅金科技有限公司合成；iturin A購自美國Sigma公司。

正十六烷、鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷 上海麥克林生化科技有限公司；曲拉通 北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；考馬斯亮藍(lán)R-250 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；Nisaplin 丹尼斯克（中國）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-6100紫外-可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；SW-CJ-2F潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ZEEnit700P原子吸收光譜儀 德國耶拿分析儀器股份公司；MOS-450圓二色光譜儀 法國Bio-Logic公司；SCIENTZ-48L冷凍型高通量組織研磨器 寧波新芝生物科技股份有限公司；GI80TW高壓蒸汽滅菌鍋致微（廈門）儀器有限公司；ZQZY-85CS振蕩培養(yǎng)箱上海知楚儀器有限公司；Gel-Doc XRS免疫電泳成像系統(tǒng)美國Bio-Rad科技公司；RF-5301PC熒光分光光度計(jì)島津企業(yè)管理中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌生長的影響

參照孟兆麗[8]的方法并稍作修改，將Nisaplin、抗菌肽SP-AP-1和iturin A分別加入金黃色葡萄球菌菌懸液（菌液濃度為108CFU/mL）中，使其終質(zhì)量濃度均為1 MIC。37 ℃、200 r/min連續(xù)培養(yǎng)24 h，每隔2 h進(jìn)行取樣，測定OD600nm，繪制生長曲線，以未加入抗菌樣品溶液的金黃色葡萄球菌作為空白對(duì)照。

1.3.2 抗菌肽對(duì)細(xì)菌細(xì)胞表面疏水性的影響

表面疏水性的測定參照Hou Lixia[9]和Pelletier[10]等的方法并稍作修改，采用0.02 mol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌對(duì)數(shù)期金黃色葡萄球菌并用0.1 mol/L KNO3溶液重懸（菌液濃度為108CFU/mL），依次將質(zhì)量濃度分別為1、1/2、1/4、1/8 MIC的兩種抗菌肽溶液與菌懸液等體積混合，對(duì)照組為等量PBS。37 ℃、200 r/min培養(yǎng)30 min，測定OD405nm（OD0）；然后吸取體積為1.2 mL的菌懸液，向其中加入200 μL十六烷，25 ℃搖床混勻2 min，靜置15 min，直至菌懸液和十六烷兩相溶液完全分層，小心吸取水相，測定OD405nm（OD1）。細(xì)菌細(xì)胞表面疏水性按下式計(jì)算。

1.3.3 抗菌肽對(duì)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜滲透性的影響

參照Ibrahim等[11]的方法并稍作修改，吸取1 mL對(duì)數(shù)生長期金黃色葡萄球菌菌液，8 000 r/min離心15 min，收集菌體沉淀并用己滅菌的生理鹽水清洗兩次，然后將洗滌后的菌液加入到10 mL的M9乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)8 h，離心，洗滌菌體沉淀并用β-半乳糖苷酶反應(yīng)緩沖液將其重懸，使其OD630nm在0.2左右。吸取重懸液1.6 mL，分別向其中加入200 μL 質(zhì)量濃度為1 MIC的兩種抗菌肽溶液，再加入200 μL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷，混合均勻，37 ℃水浴5 h，間隔1 h測定OD405nm的變化情況，陰性對(duì)照為PBS，陽性對(duì)照為曲拉通。

M9乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基（以1 L滅菌水計(jì)）：乳糖5 g、Na2HPO4·7H2O 12.8 g、NaCl 0.5 g、NH4Cl 1 g、KH2PO43 g、CaCl20.01 g、MgSO40.5 g，121 ℃、0.1 MPa濕熱滅菌15～20 min。

β-半乳糖苷酶反應(yīng)緩沖液（以1 L滅菌水計(jì)）：Na2HPO4·12H2O 2.9 g、NaCl 8 g、KH2PO40.24 g、KCl 0.2 g、MgSO40.25 g、β-硫基乙醇0.39 g。

1.3.4 抗菌肽對(duì)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)K+泄漏的影響

將金黃色葡萄球菌菌懸液（ 菌液濃度為108CFU/mL）分別與質(zhì)量濃度1 MIC的兩種抗菌肽混合，37 ℃孵育一定時(shí)間，10 000 r/min離心10 min，對(duì)照組為金黃色葡萄球菌菌懸液（菌液濃度為108CFU/mL，不添加任何抗菌肽溶液），采用原子吸收光譜儀測定上述上清液中K+質(zhì)量濃度的變化情況，每隔10 min記錄一次，共記錄7 次。

1.3.5 抗菌肽對(duì)細(xì)菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的影響

1.3.5.1 菌體胞內(nèi)蛋白質(zhì)相對(duì)含量的測定

參照郭娟等[12]的方法，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的金黃色葡萄菌10 000 r/min離心15 min，收集菌體并重懸為108CFU/mL菌懸液，在100 mL菌懸液中分別加入質(zhì)量濃度0.5 mg/mL的SP-AP-1和iturin A（終質(zhì)量濃度均為1 MIC）和質(zhì)量濃度0.5 mg/mL Nisaplin，對(duì)照組加入等體積無菌蒸餾水，37 ℃恒溫培養(yǎng)，分別取間隔培養(yǎng)1 h的菌懸液10 mL，離心，收集菌體沉淀并用PBS洗滌兩次。將沉淀轉(zhuǎn)移至研缽，液氮研磨，加入500 μL 20 g/100 mL三氯乙酸和400 μL超純水，冰浴10 min后離心取沉淀。用10 g/100 mL三氯乙酸再次重懸取沉淀，將菌體轉(zhuǎn)移至無菌試管中，加入100 μL生理鹽水重懸，再加入5 mL考馬斯亮藍(lán)染色液，室溫放置30 min后在595 nm波長處測定OD595nm。

1.3.5.2 菌體蛋白十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)液重懸后，分別加入兩種抗菌肽溶液（質(zhì)量濃度設(shè)置：1 MIC和5 MIC），為確保實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)采取兩次對(duì)照（加入等體積的無菌蒸餾水），37 ℃、200 r/min培養(yǎng)8 h，8 000 r/min離心20 min，收集菌體，向菌體沉淀中加入500 μL PBS和0.3 g石英砂，8 000 r/min離心4 min，收集上清液，取20 μL上清液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析。

1.3.6 抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌基因組DNA的影響

參考寧亞維等[13]的方法并稍作修改。采用DNA提取試劑盒對(duì)金黃色葡萄球菌基因組DNA進(jìn)行提取，利用凝膠阻滯法觀察SP-AP-1和iturin A對(duì)金黃色葡萄球菌基因組DNA的影響。將金黃色葡萄球菌基因組DNA與質(zhì)量濃度分別為1、2、3 MIC和4 MIC的兩種抗菌肽溶液按照體積比1∶1混合，對(duì)照組為金黃色葡萄球菌基因組DNA（不添加抗菌肽溶液），總反應(yīng)體積為4 μL。充分混勻后，37 ℃恒溫水浴60 min。反應(yīng)結(jié)束后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察并分析基因組DNA的遷移結(jié)果。

1.3.7 抗菌肽作用于細(xì)菌細(xì)胞膜時(shí)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

分別采用30 mmol/L SDS溶液和10 mmol/L PBS將兩種抗菌肽配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的溶液，在石英比色皿中加入一定體積的抗菌肽溶液，25 ℃下用圓二色光譜儀對(duì)樣品進(jìn)行180～260 nm的遠(yuǎn)紫外掃描并采集數(shù)據(jù)，掃描速率50 nm/min，帶寬1.0 nm。對(duì)掃描后的所有圖譜用CDNN軟件進(jìn)行減噪處理并對(duì)樣品溶液的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量進(jìn)行擬合計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 19軟件與Origin 9.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Duncan法進(jìn)行顯著差異性比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌生長的影響

由圖1可知，添加抗菌肽SP-AP-1和iturin A的金黃色葡萄球菌菌液在培養(yǎng)4 h后其生長曲線均發(fā)生明顯變化，菌液質(zhì)量濃度逐漸降低，8 h后OD600nm逐漸趨于穩(wěn)定，而對(duì)照組菌落生長正常，無明顯變化，表明兩種抗菌肽均能夠在金黃色葡萄球菌的對(duì)數(shù)生長期內(nèi)抑制其生長繁殖，且SP-AP-1比iturin A有更強(qiáng)的抑制作用。

圖1 抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌生長的影響Fig.1 Effects of antimicrobial peptides on the growth of S.aureus

2.2 抗菌肽對(duì)細(xì)菌細(xì)胞表面疏水性的影響

正十六烷是一種有機(jī)相，金黃色葡萄球菌在水相和有機(jī)相中的吸附率是不同的，因此，細(xì)菌細(xì)胞表面疏水性的改變可由吸附率來反映[14]。如圖2所示，當(dāng)抗菌肽SP-AP-1和iturin A作用于金黃色葡萄球菌后，各組間和組內(nèi)的細(xì)胞吸附率均存在顯著性差異（P＜0.05）。其中，經(jīng)iturin A處理后，金黃色葡萄球菌細(xì)胞吸附率從PBS組的77.3%降為37.6%，而經(jīng)SP-AP-1處理的菌液細(xì)胞吸附率僅為33.5%，兩種抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞吸附率的影響均呈濃度依賴性。有研究表明，細(xì)胞表面疏水位點(diǎn)主要為蛋白質(zhì)-脂類和糖-脂類等物質(zhì)[15]，故推測細(xì)胞表面疏水性降低的可能原因?yàn)榭咕呐c金黃色葡萄球菌細(xì)胞表面相互作用，吸引電負(fù)性基團(tuán)造成重排，從而導(dǎo)致金黃色葡萄球菌細(xì)胞表面電負(fù)性增強(qiáng)，疏水性下降[16]。

圖2 抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞表面疏水性的影響Fig.2 Effects of antimicrobial peptides on the cell surface hydrophobicity of S.aureus

2.3 抗菌肽對(duì)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜滲透性的影響

細(xì)菌經(jīng)乳糖誘導(dǎo)后，其細(xì)胞內(nèi)膜上能產(chǎn)生一種將乳糖水解成半乳糖和葡萄糖的β-半乳糖苷酶[17]。鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷可作為乳糖替代物被β-半乳糖苷酶水解成半乳糖和黃色的鄰-硝基苯酚，故通過測定反應(yīng)體系中OD值來反映抗菌肽對(duì)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜的破壞程度[18]。

圖3 抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)膜通透性的影響Fig.3 Effects of antimicrobial peptides on the permeability of S.aureus cell membrane

由圖3可知，當(dāng)抗菌肽作用于金黃色葡萄球菌后，兩種抗菌肽的OD405nm均隨時(shí)間的延長而增大，且在3 h時(shí)OD405nm達(dá)到最高，反應(yīng)體系進(jìn)行到5 h時(shí)，SP-AP-1組OD405nm顯著高于iturin A組（P＜0.05）。而在整個(gè)反應(yīng)過程中，PBS陰性對(duì)照組基本無明顯變化，其OD405nm穩(wěn)定在0.42左右，這表明添加SP-AP-1和iturin A對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)膜造成了一定的損傷作用，導(dǎo)致其細(xì)胞內(nèi)膜滲透性增大、通透性增強(qiáng)，底物鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量增多，β-半乳糖苷酶催化分解速率加快，故黃色產(chǎn)物鄰-硝基苯酚增多，OD405nm增大。隨著時(shí)間的延長，由于β-半乳糖苷酶數(shù)量有限，催化分解的速率達(dá)到最大值時(shí)，OD405nm不再隨底物鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷的增加而增大，而是保持相對(duì)穩(wěn)定的趨勢。這與趙廣旭[19]和張宇[20]自主設(shè)計(jì)的抗菌多肽具有類似作用效果，說明抗菌肽通過引起細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜通透性改變，達(dá)到抑制或殺死細(xì)胞的效果。

2.4 抗菌肽對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜內(nèi)K+的泄漏影響

圖4 抗菌肽誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)K＋釋放量的變化Fig.4 Effect of antimicrobial peptides on the release of intracellular potassium ions from S.aureus

細(xì)胞內(nèi)K+的泄漏是離子泄漏的典型代表之一，其泄漏程度可反映抗菌肽作用于細(xì)胞時(shí)細(xì)胞膜的損傷程度[21-22]。由圖4可知，金黃色葡萄球菌經(jīng)SP-AP-1和iturin A處理后，其胞內(nèi)K+釋放量隨時(shí)間的延長均呈快速增長趨勢，而對(duì)照組變化不明顯，表明SP-AP-1和iturin A均能使金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，且比較兩種抗菌肽的作用效果發(fā)現(xiàn)，SP-AP-1比iturin A對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的透化作用更強(qiáng)（P＜0.05），這與2.3節(jié)中抗菌肽對(duì)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜的滲透性影響結(jié)果相符，充分說明SP-AP-1和iturin A均能與金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜相互作用，破壞其細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致菌體死亡。然而SP-AP-1和iturin A引起金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜完整性的破壞是否是導(dǎo)致其細(xì)胞死亡的主要原因還需進(jìn)一步研究。

2.5 抗菌肽對(duì)細(xì)菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的影響

2.5.1 菌體胞內(nèi)蛋白相對(duì)含量分析結(jié)果

圖5 抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌胞內(nèi)蛋白相對(duì)含量的影響Fig.5 Effects of antimicrobial peptides on intracellular protein content of S.aureus

由圖5可知，對(duì)照組胞內(nèi)蛋白相對(duì)含量隨時(shí)間的延長而持續(xù)增加，且在10 h后保持穩(wěn)定，而添加抗菌肽的實(shí)驗(yàn)組金黃色葡萄球菌胞內(nèi)蛋白相對(duì)含量均呈先增加后降低的趨勢。郭娟等[12]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽與細(xì)菌作用后，短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞膜受損但尚未破裂，故其胞內(nèi)蛋白相對(duì)含量表現(xiàn)出升高趨勢。添加SP-AP-1和iturin A的實(shí)驗(yàn)組金黃色葡萄球菌胞內(nèi)蛋白相對(duì)含量分別在4 h和6 h后急劇下降，且兩組具有顯著性差異（P＜0.05），這可能是因?yàn)榻瘘S色葡萄球菌細(xì)胞膜的破裂導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白相對(duì)含量降低，也可能是由于抗菌肽進(jìn)入細(xì)胞后使其DNA轉(zhuǎn)錄和翻譯過程受到抑制，因而菌體本身胞內(nèi)蛋白含量降低[4]。

2.5.2 菌體蛋白十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果

圖6 菌體蛋白SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.6 SDS-PAGE analysis of the effect of antimicrobial peptides on intracellular proteins of S.aureus

由圖6可知，對(duì)照組胞內(nèi)蛋白條帶完整清晰，而經(jīng)抗菌肽SP-AP-1和iturin A處理后的實(shí)驗(yàn)組金黃色葡萄球菌胞內(nèi)蛋白出現(xiàn)不同程度的缺失現(xiàn)象。其中，蛋白條帶缺失較多的部分主要集中在分子質(zhì)量17、20、25～35 kDa，說明兩種抗菌肽可影響金黃色葡萄球菌的基因轉(zhuǎn)錄或翻譯功能，進(jìn)而抑制其蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致金黃色葡萄球菌胞內(nèi)分子質(zhì)量17、20、25～35 kDa之間的蛋白含量降低；同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)兩種抗菌肽質(zhì)量濃度從1 MIC增大到5 MIC時(shí)，分子質(zhì)量在48～75 kDa之間的蛋白也會(huì)發(fā)生明顯的缺失現(xiàn)象，金黃色葡萄球菌的蛋白條帶清晰度明顯下降，顏色明顯變淺，特別是經(jīng)質(zhì)量濃度5 MIC抗菌肽SP-AP-1處理后，金黃色葡萄球菌胞內(nèi)蛋白條帶幾乎沒有，說明增大抗菌肽SP-AP-1質(zhì)量濃度，金黃色葡萄球菌胞內(nèi)蛋白含量急劇降低，金黃色葡萄球菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成完全受到抑制。因此，SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明抗菌肽進(jìn)入金黃色葡萄球菌細(xì)胞后，抑制其胞內(nèi)蛋白合成，從而導(dǎo)致菌體死亡，且高質(zhì)量濃度的抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌具有更強(qiáng)的抑制效果。陳飛龍等[4]研究了抗菌肽F1對(duì)金黃色葡萄球菌的胞內(nèi)作用機(jī)制，也發(fā)現(xiàn)抗菌肽F1能夠造成分子質(zhì)量20～30 kDa的蛋白含量降低，蛋白條帶顏色顯著變淺。

2.6 抗菌肽對(duì)菌體基因組DNA的影響

圖7 抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌基因組DNA的影響Fig.7 Effect of antimicrobial peptides on genomic DNA of S.aureus

如圖7所示，不同質(zhì)量濃度的抗菌肽SP-AP-1和iturin A作用于金黃色葡萄球菌后，菌體DNA條帶并未發(fā)生明顯的遷移現(xiàn)象，且部分DNA滯留于上樣孔內(nèi)，這可能是因?yàn)殡姾呻娯?fù)性發(fā)生改變或DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)改變，從而影響DNA遷移率[23-24]。增大兩種抗菌肽質(zhì)量濃度，iturin A作用的金黃色葡萄球菌菌體DNA條帶遷移率和亮度沒有明顯變化，而SP-AP-1作用的金黃色葡萄球菌菌體DNA條帶亮度逐漸變暗、顏色變淺，這是由于抗菌肽與溴化乙錠競爭性結(jié)合DNA[25]，使金黃色葡萄球菌的基因功能受到影響，從而抑制其生長繁殖。Li Lirong等[26]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞穿透肽衍生物可與溴化乙錠競爭性結(jié)合傷寒沙門氏菌DNA，從而導(dǎo)致菌體死亡；郭娟[12]和陳璇[27]等的研究也均證實(shí)了此觀點(diǎn)。因此，雖然兩種抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌基因組DNA沒有明顯阻滯作用，但推測抗菌肽SP-AP-1可能與溴化乙錠競爭性結(jié)合DNA，使核酸合成受到抑制，而抗菌肽iturin A不能達(dá)到此效果。

2.7 抗菌肽作用于細(xì)菌細(xì)胞膜時(shí)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化分析結(jié)果

抗菌肽的抑菌活性與其二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化密切相關(guān)[28]。圓二色光譜法是目前測定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、研究蛋白質(zhì)在稀溶液中的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象變化的較為準(zhǔn)確和應(yīng)用廣泛的方法之一[29]。本實(shí)驗(yàn)利用圓二色光譜法對(duì)兩種抗菌肽在PBS和SDS疏水環(huán)境下的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行研究分析（圖8）。

圖8 兩種抗菌肽在PBS和SDS緩沖液中的圓二色光譜Fig.8 Circular dichroism spectra of two antimicrobial peptides in PBS and SDS buffers

表1 兩種抗菌肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量Table 1 Proportions of secondary structures in two antimicrobial peptides

兩種抗菌肽在不同環(huán)境下的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量見表1。當(dāng)抗菌肽SP-AP-1處于PBS體系中時(shí)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)卷曲（相對(duì)含量43.3%）為主；當(dāng)抗菌肽SP-AP-1處于SDS緩沖液體系中時(shí)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)卷曲相對(duì)含量減少，α-螺旋、反向平行、平行及β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量均有所增加，β-折疊（反向平行和平行）相對(duì)含量增加幅度最為明顯；而抗菌肽iturin A二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量變化主要以β-轉(zhuǎn)角為主，當(dāng)抗菌肽iturin A從PBS體系轉(zhuǎn)變到SDS緩沖液體系后，其二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量從6.7%增加到27.5%。有研究表明，大部分抗菌肽通常在液體環(huán)境中的二級(jí)結(jié)構(gòu)都是以無規(guī)卷曲為主，當(dāng)抗菌肽接觸細(xì)菌細(xì)胞膜后，其結(jié)構(gòu)或構(gòu)象會(huì)發(fā)生一定程度的變化，這種構(gòu)象變化與其抗菌活性緊密相關(guān)[30]。因此，本實(shí)驗(yàn)中兩種抗菌肽在緩沖液環(huán)境及模擬膜的疏水環(huán)境下二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化間接反映了當(dāng)抗菌肽作用于金黃色葡萄球菌時(shí)的抑菌機(jī)制。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以螺旋藻渣抗菌肽SP-AP-1和iturin A為研究對(duì)象，對(duì)比了兩種抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)制。結(jié)果表明，iturin A主要通過引起金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜通透性增加、抑制菌體蛋白合成，從而抑制菌體生長繁殖；而SP-AP-1對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)制則是影響細(xì)胞膜通透性、抑制蛋白合成和競爭性結(jié)合DNA共同作用的結(jié)果，且其抑制效果比iturin A更為明顯，為進(jìn)一步探究抗菌肽SP-AP-1的廣譜抗菌機(jī)制提供了一定的理論指導(dǎo)。