阮紅日，王宇輝，徐若洋，陳 立，靳育琦，王建發(fā)，宋 軍,*，鄭家三,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江省牛病防制重點實驗室，黑龍江 大慶 163319）

食品安全是關(guān)系到人類健康與國家發(fā)展的重大問題，而食源性致病菌污染是食品安全的首要問題。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）作為重要的食源性致病菌，無論在發(fā)達國家還是在發(fā)展中國家，因其引起的食物中毒在細菌性食物中毒中均占有較大比例[1-2]。索玉娟等[3]對食品中毒污染源進行監(jiān)測和追蹤發(fā)現(xiàn)，生鮮肉、乳制品、速凍食品等受金黃色葡萄球菌污染嚴(yán)重。因此，有效防控金黃色葡萄球菌污染對于食品行業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。

噬菌體是一類細菌病毒，具有嚴(yán)格的宿主特異性，可在宿主菌內(nèi)復(fù)制并破壞宿主菌，對動植物和人體無害[4]。近年來，噬菌體作為一種天然的抗菌劑備受關(guān)注，在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越多，如利用噬菌體清除奶酪中的金黃色葡萄球菌[5]；利用噬菌體雞尾酒降低牛奶、雞胸肉和白菜中沙門氏菌（Salmonella）濃度[6]；利用噬菌體抑制生魚片組織表面單核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的生長，防止生魚片腐敗[7]；利用噬菌體雞尾酒降低蔬菜和牛肉中大腸桿菌（Escherichia coli）濃度，延長貯存時間等[8]。目前，美國食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)了幾種用于食品上市前預(yù)防細菌污染的噬菌體制劑[9-10]。由此可見，噬菌體在作為食品生物抗菌劑方面具有巨大的發(fā)展?jié)摿11-12]。

本實驗以金黃色葡萄球菌ATCC 43300為宿主菌，分離裂解性噬菌體，研究其生物學(xué)特性，檢測該噬菌體對細菌及生物被膜的清除效果，并評估噬菌體在巴氏滅菌的脫脂牛奶和全脂牛奶中抑菌潛力，旨在探討噬菌體作為乳制品生產(chǎn)、加工過程中生物抗菌劑的潛在應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

金黃色葡萄球菌ATCC 43300由吉林大學(xué)顧敬敏教授饋贈；金黃色葡萄球菌Sau254分離自鮮牛乳，經(jīng)鑒定為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；污水樣品采自黑龍江省某養(yǎng)牛場。

SM緩沖液、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS） 生工生物工程（上海）股份有限公司；Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)液、瓊脂 青島海博生物技術(shù)有限公司；24 孔細胞爬片、結(jié)晶紫、二苯甲亞胺、十二烷基硫酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨、聚乙二醇辛基苯基醚和3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸 北京索萊寶科技有限公司；96 孔細胞培養(yǎng)板、24 孔細胞培養(yǎng)板無錫耐思生物科技有限公司；巴氏滅菌牛奶、304型不銹鋼片為市售。

1.2 儀器與設(shè)備

DRP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司；5810R高速冷凍離心機 德國艾本德股份公司；T6分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Ti2熒光顯微鏡 日本尼康公司；JEM-2100 Plus透射電子顯微鏡 日本電子株式會社。

1.3 方法

1.3.1 噬菌體分離純化及形態(tài)觀察

采集養(yǎng)牛場污水500 mL，參照J(rèn)amalludeen等[13]的方法分離噬菌體。污水用濾紙過濾后，5 000×g離心15 min，除去污水中雜質(zhì)，使用0.45 μm的半透膜對水樣進行濃縮，最后用0.22 μm濾膜過濾除菌。將100 mL 2×LB培養(yǎng)液和1 mL培養(yǎng)至對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌ATCC 43300菌液加入處理后的污水中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日采用雙層平板法對分離到的噬菌體進行純化。將純化后的噬菌體用SM緩沖液10 倍連續(xù)稀釋，每個稀釋度取100 μL稀釋液加入100 μL宿主菌中制成雙層平板，按下式[14]計算噬菌體效價。

式中：噬菌斑數(shù)為3 組重復(fù)實驗的每個平板上噬菌斑數(shù)量的平均數(shù)/PFU；稀釋倍數(shù)為經(jīng)過10 倍連續(xù)稀釋后最終的稀釋倍數(shù)；0.1為最初取液量（100 μL）。

采用磷鎢酸負染色法觀察噬菌體形態(tài)，將20 μL噬菌體懸液（106PFU/mL）滴于銅網(wǎng)，吸附15 min后取出銅網(wǎng)，自然干燥2～3 min，用體積分?jǐn)?shù)2%磷鎢酸水溶液染色，2 min后吸干水分，自然干燥10 min，透射電子顯微鏡觀察噬菌體形態(tài)。

1.3.2 噬菌體的生物學(xué)特性分析

1.3.2.1 最佳感染復(fù)數(shù)的測定

最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）參照Lu等[15]的測定方法，略有改動。按照不同感染比例（1∶1 000、1∶100、1∶10、1∶1、10∶1、100∶1）（噬菌體數(shù)∶細菌數(shù)）將噬菌體和對數(shù)生長期的宿主菌混合，37 ℃振蕩培養(yǎng)（160 r/min），3.5 h后測定上清液中噬菌體效價，效價最高的比例即為MOI。

1.3.2.2 一步生長曲線的繪制

一步生長曲線可以反映噬菌體從吸附宿主菌到釋放子代噬菌體的完整增殖周期[16]。將噬菌體和對數(shù)生長期的宿主菌以MOI＝1∶100混合，37 ℃靜置培養(yǎng)15 min后12 000×g離心，棄上清液，使用50 mL預(yù)熱的LB培養(yǎng)液重懸細菌細胞沉淀，迅速置于37 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)（160 r/min）。分別于不同時間測定培養(yǎng)液中噬菌體效價。以取樣時間為橫坐標(biāo)，噬菌體效價為縱坐標(biāo)，繪制一步生長曲線。

1.3.2.3 pH值穩(wěn)定性實驗

取1 mL效價約為108PFU/mL的噬菌體于試管中，分別加入1 mL pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的SM緩沖液，室溫作用1 h，稀釋適當(dāng)倍數(shù)并通過雙層平板法測定噬菌體效價。

1.3.2.4 熱穩(wěn)定性實驗

取1 mL效價約為108PFU/mL的噬菌體于試管中，分別在20、30、40、50、60、70 ℃水浴作用1 h，稀釋適當(dāng)倍數(shù)并通過雙層平板法測定噬菌體效價。

1.3.3 噬菌體對乳源金黃色葡萄球菌的清除作用

1.3.3.1 噬菌體對金黃色葡萄球菌Sau254的裂解作用

將Sau254菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期，PBS洗滌去除培養(yǎng)基，并調(diào)整細菌濃度為1010PFU/mL，加入1 mL效價約為107PFU/mL的噬菌體于37 ℃靜置培養(yǎng)，分別于0、1、2、4、6、8、12、24 h測定培養(yǎng)液中細菌濃度以及噬菌體效價。

1.3.3.2 噬菌體對生物被膜的清除效果

參照Torlak等[17]的方法，在96 孔板上培養(yǎng)成熟的金黃色葡萄球菌生物被膜，用PBS洗滌3 次去除浮游菌和培養(yǎng)基，之后加入200 μL效價約為107PFU/mL的噬菌體溶液，分別于0、4、8、12、24、48 h通過稀釋平板涂布法測定生物被膜內(nèi)細菌數(shù)量，并通過結(jié)晶紫染色法確定噬菌體對細菌生物被膜清除效果。將噬菌體處理后的生物被膜樣品用PBS緩慢清洗3 次，去除浮游細菌和培養(yǎng)基，之后每孔加入200 μL體積分?jǐn)?shù)95%的甲醇溶液，室溫固定30 min，再用PBS沖洗3 次，自然晾干后每孔加入0.1%的結(jié)晶紫溶液染色30 min，流水沖洗每孔2～3 次，最后每孔加入200 μL體積分?jǐn)?shù)30%冰乙酸作用15 min，使用分光光度計測定OD600nm，記錄數(shù)據(jù)。

1.3.3.3 熒光顯微鏡觀察

按1.3.3.2節(jié)的方法，在24 孔細胞爬片上培養(yǎng)成熟的細菌生物被膜，加入2 mL效價約為107PFU/mL的噬菌體溶液，分別處理0、24、48 h，PBS洗滌3 次去除游離細菌，之后使用二苯甲亞胺染色3～5 min，封片后置于熒光顯微鏡下觀察膜內(nèi)細菌密度，以0 h未經(jīng)噬菌體處理的生物被膜作為對照組，分析噬菌體對生物被膜的清除效果。

1.3.4 噬菌體在牛奶中的抑菌應(yīng)用

將Sau254菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期，PBS洗滌去除培養(yǎng)基，分別使用脫脂牛奶和全脂牛奶將細菌終濃度稀釋為1×104CFU/mL，設(shè)立實驗組和對照組。實驗組加入1 mL效價約為107PFU/mL的噬菌體，對照組加入等體積的PBS，分別置于4 ℃和25 ℃中靜置培養(yǎng)，分別于0、4、8、12、24 h測定脫脂和全脂牛奶中細菌濃度以及噬菌體效價。

1.3.5 噬菌體對不銹鋼材料上生物被膜的清除作用

參照鄧旗等[18]的方法，略有改動。將不銹鋼片用NaOH和丙酮處理后，移入培養(yǎng)液中，按1.3.3.2節(jié)的方法培養(yǎng)生物被膜。之后加入2 mL效價約為107PFU/mL的噬菌體溶液，分別于0、4、8、12、24、48、72 h測定生物被膜內(nèi)細菌數(shù)量和上清液中噬菌體效價。

1.3.6 常用洗滌劑對噬菌體活性的影響

取效價約為108PFU/mL的噬菌體分別與SM緩沖液、陰離子洗滌劑（1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）十二烷基硫酸鈉）、陽離子洗滌劑（1%十六烷基三甲基溴化銨）、非離子洗滌劑（1%聚乙二醇辛基苯基醚）和兩性離子洗滌劑（1% 3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸）等體積混合，37 ℃作用30 min，通過雙層平板法測定各組洗滌劑中噬菌體效價，以SM緩沖液作為對照組，評價各種洗滌劑對噬菌體活性的影響。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。兩組間比較采用studentt檢驗，以P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體的形態(tài)觀察結(jié)果

從養(yǎng)牛場采集的污水中分離出一株噬菌體，其噬菌斑呈現(xiàn)出典型裂解性噬菌體特征（圖1），透亮且有暈環(huán)，直徑為1.5～2.0 mm，雙層平板法測定噬菌體效價為1×108PFU/mL。

圖1 噬菌斑形態(tài)Fig.1 Morphology of plaques

2.2 噬菌體透射電子顯微鏡觀察結(jié)果

圖2 噬菌體透射電子顯微鏡圖（30 000×）Fig.2 TEM of phages (30 000 ×)

如圖2所示，噬菌體頭部呈正多面體，頭部直徑（83.0±0.5）nm，尾部長度（140±1）nm，其尾部可收縮，按國際病毒分類委員會分類規(guī)則，符合肌尾噬菌體科特征，因此命名為vB_SauM_RS。

2.3 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)和一步生長曲線分析結(jié)果

當(dāng)MOI＝1∶100時噬菌體產(chǎn)出量最高（圖3A），因此，按1∶100的比例繪制一步生長曲線。由圖3B可知，噬菌體vB_SauM_RS在感染宿主細菌后的20 min內(nèi)效價幾乎保持不變，表明該噬菌體潛伏期約為20 min，在感染宿主細菌后20～50 min，噬菌體效價急劇增加，可知vB_SauM_RS爆發(fā)期約為30 min，噬菌體的平均裂解量為39 PFU/cell（裂解量＝爆發(fā)末期噬菌體效價/感染初期宿主菌濃度）。

圖3 噬菌體vB_SauM_RS MOI（A）和一步生長曲線（B）Fig.3 MOI (A) and one-step growth curve (B) of phage vB_SauM_RS

2.4 噬菌體pH值穩(wěn)定性

圖4 噬菌體vB_SauM_RS pH值穩(wěn)定性Fig.4 pH sensitivity of phage vB_SauM_RS

由圖4可知，vB_SauM_RS在pH 4.0～11.0時效價與初始效價（約108PFU/mL）無明顯差異，且具有良好的裂解活性，說明該噬菌體對酸堿的耐受力較強；當(dāng)pH值低于4.0或者高于11.0時噬菌體基本失活，說明vB_SauM_RS的穩(wěn)定pH值范圍為pH 4.0～11.0。

2.5 噬菌體熱穩(wěn)定性

圖5 噬菌體vB_SauM_RS熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermal stability of phage vB_SauM_RS

由圖5可知，vB_SauM_RS在20～50 ℃內(nèi)活性保持穩(wěn)定，60 ℃時噬菌體效價降低至初始效價的50%以下，在高溫（70 ℃）時全部失活。因此，vB_SauM_RS對高溫耐受性較差，適合在50 ℃及以下溫度生存。

2.6 噬菌體對金黃色葡萄球菌Sau254的裂解作用

圖6 噬菌體vB_SauM_RS對金黃色葡萄球菌的裂解作用Fig.6 Lytic effect of phage vB_SauM_RS on S.aureus

由圖6可知，vB_SauM_RS作用24 h后，細菌濃度由1×1010CFU/mL降至0 CFU/mL，而vB_SauM_RS效價從105PFU/mL增至108PFU/mL。Sau254濃度隨vB_SauM_RS作用時間延長不斷降低，vB_SauM_RS效價不斷增加，表明vB_SauM_RS能夠持續(xù)有效抑制和清除細菌。噬菌體效價在8 h升至108PFU/mL后趨于穩(wěn)定，表明vB_SauM_RS增殖具有自我限制。

2.7 噬菌體對生物被膜的清除效果

圖7 噬菌體vB_SauM_RS對生物被膜的清除效果Fig.7 Removal effect of phage vB_SauM_RS on biofilm

由圖7 可知，成熟的生物被膜內(nèi)細菌濃度為5.28（lg（CFU/mL）），隨著vB_SauM_RS處理時間的延長被膜內(nèi)細菌濃度不斷減少，作用4 h后細菌濃度下降至4.97（lg（CFU/mL）），作用12 h被膜內(nèi)細菌濃度下降至4.48（lg（CFU/mL）），作用48 h后細菌濃度下降至3.94（lg（CFU/mL））（生物被膜內(nèi)細菌濃度降低了95.6%），表明vB_SauM_RS對生物被膜有良好的清除效果；結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，噬菌體處理48 h后，OD600nm由0.83降至0.36，同樣表明vB_SauM_RS對生物被膜具有良好的清除效果。

2.8 熒光顯微鏡觀察結(jié)果

由圖8可知，Sau254菌株可在細胞爬片上形成致密的生物被膜結(jié)構(gòu)。與對照組相比，vB_SauM_RS處理24 h和48 h后細菌呈分散分布，少有聚集的現(xiàn)象，且被膜內(nèi)細菌密度明顯減小，表明vB_SauM_RS可以破壞生物被膜結(jié)構(gòu)并且對膜內(nèi)細菌有較強的清除能力。

圖8 熒光顯微鏡觀察生物被膜Fig.8 Observation of biofilm by fluorescence microscope

2.9 噬菌體在牛奶中的抑菌作用結(jié)果

由圖9A可知，在4 ℃條件下，脫脂牛奶中加入vB_SauM_RS作用4 h時，噬菌體與細菌的濃度均升高，但在8 h時實驗組與對照組Sau254濃度出現(xiàn)不同的變化。當(dāng)作用24 h時，實驗組Sau254濃度較對照組下降了1.079（lg（CFU/mL））；由圖9B可知，在4 ℃條件下，全脂牛奶中加入vB_SauM_RS前12 h實驗組和對照組Sau254濃度均升高，沒有出現(xiàn)明顯的差異，但在作用24 h時，實驗組Sau254濃度較對照組下降了1.021（lg（CFU/mL））；在25 ℃條件下，于脫脂牛奶和全脂牛奶中分別加入vB_SauM_RS作用24 h后，實驗組Sau254濃度較對照組分別下降了5.418（lg（CFU/mL））（圖9C）和5.740（lg（CFU/mL））（圖9D）。結(jié)果表明，vB_SauM_RS在脫脂和全脂牛奶中對Sau254均具有良好的抑制作用，并且對低溫保存牛奶中Sau254同樣具有抑制作用。實驗組中vB_SauM_RS效價從初始5×106PFU/mL升至108PFU/mL，表明vB_SauM_RS能利用宿主菌進行自我增殖，不斷擴大優(yōu)勢，最終抑制細菌生長。并且噬菌體效價會維持在較高的水平，產(chǎn)生持續(xù)的抑菌作用。

圖9 噬菌體vB_SauM_RS在牛奶中的抑菌作用Fig.9 Bacteriostatic effect of phage vB_SauM_RS in milk

2.10 噬菌體對不銹鋼板材料上生物被膜的清除作用

圖10 噬菌體vB_SauM_RS對不銹鋼片表面生物被膜的清除作用Fig.10 Removal effect of phage vB_SauM_RS on biofilms formed on stainless steel sheet

由圖10可知，vB_SauM_RS對不銹鋼上生物被膜的清除效果明顯，作用72 h后Sau254濃度由初始6.8×104CFU/mL降至3.5×102CFU/mL，被膜內(nèi)細菌數(shù)量降低了99.5%，具有明顯的清除效果。噬菌體效價由107PFU/mL升至108PFU/mL，結(jié)果表明其能夠?qū)ι锉荒け３殖掷m(xù)的清除作用。

2.11 常用洗滌劑對噬菌體活性的影響

圖11 常用洗滌劑對噬菌體vB_SauM_RS活性的影響Fig.11 Effect of common cleaning agents on the activity of phage vB_SauM_RS

由圖11可知，非離子洗滌劑聚乙二醇辛基苯基醚和兩性離子洗滌劑3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸對vB_SauM_RS活性并無顯著影響，而陽離子洗滌劑十六烷基三甲基溴化銨能夠使vB_SauM_RS效價下降2.1（lg（PFU/mL）），陰離子洗滌劑十二烷基硫酸鈉中的vB_SauM_RS完全失去活性。表明噬菌體vB_SauM_RS對陰離子洗滌劑和陽離子洗滌劑敏感，應(yīng)避免與它們同時使用；而非離子洗滌劑和兩性離子洗滌劑對vB_SauM_RS裂解活性無明顯影響，可聯(lián)合應(yīng)用。

3 討 論

與傳統(tǒng)的抗菌劑相比，噬菌體作為一種天然的抗菌劑具有先天優(yōu)勢，在自然界廣泛分布、對正常菌群無影響、有長期使用史[4]。目前許多研究機構(gòu)致力于噬菌體制劑的研發(fā)，以期減少細菌污染問題[19]。牛奶和乳制品在貯存、運輸和加工過程中極易被細菌污染，嚴(yán)重影響牛乳品質(zhì)，其中金黃色葡萄球菌污染較為常見[20]。因此，研究噬菌體對牛奶中金黃色葡萄球菌的防控和對乳制品行業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。

本實驗分離的噬菌體vB_SauM_RS屬于有尾噬菌體目、肌尾噬菌體科。該噬菌體潛伏期20 min，在50 ℃以下、pH 4.0～11.0范圍內(nèi)活性穩(wěn)定，具有良好的環(huán)境耐受能力。vB_SauM_RS在適宜條件下24 h可完全清除濃度為1×1010CFU/mL的金黃色葡萄球菌，具有高效的裂解效率。良好的環(huán)境耐受能力和高效的裂解效率是vB_SauM_RS作為生物抗菌劑的應(yīng)用基礎(chǔ)。噬菌體vB_SauM_RS在牛奶中的抑菌實驗結(jié)果表明，在4 ℃和25 ℃條件下，其均可明顯降低牛奶中細菌濃度，這與蔡天舒等[21]的研究結(jié)果相同，但在低溫條件下抑菌效果相對較弱，可能是由于低溫影響了噬菌體的吸附能力，也可能是低溫抑制了微生物的生長從而限制噬菌體的增殖[22]。Gill等[23]認(rèn)為牛奶中的脂肪顆粒和乳清蛋白等對噬菌體抑菌作用存在影響，與本實驗結(jié)果不同，可能是因為巴氏滅菌法改變了牛奶中部分物質(zhì)的活性。

在實際生產(chǎn)中，細菌為適應(yīng)外界環(huán)境多以生物被膜的形式附著于物體表面，難以清除。有研究表明，噬菌體可以有效防控常見食源性細菌，但僅限于對浮游細菌有防控作用[24-26]。而在牛奶貯存、運輸和加工過程中很難一直保持無菌狀態(tài)，極易在設(shè)備的接觸表面形成生物被膜，從而導(dǎo)致持續(xù)性污染，嚴(yán)重影響牛奶品質(zhì)[27-28]。普通的消毒殺菌措施很難清除成熟細菌生物被膜，甚至可能使細菌產(chǎn)生抗藥性，目前已有研究證實噬菌體可以有效清除或抑制細菌生物被膜[29-30]。本實驗不同材料表面生物被膜的清除效果結(jié)果表明，vB_SauM_RS對聚苯乙烯、玻璃、不銹鋼表面生物被膜均具有良好的清除效果，可明顯降低膜內(nèi)細菌數(shù)量。實驗中細菌生物被膜雖然沒有被完全清除，但vB_SauM_RS可以破壞生物被膜的完整性，使其更容易被清除，并且噬菌體效價最終維持在108PFU/mL，能夠持續(xù)抑制生物被膜形成。因此，應(yīng)用vB_SauM_RS預(yù)防和控制乳制品生產(chǎn)加工過程中細菌生物被膜是切實可行的[31]。此外，噬菌體應(yīng)用于實際生產(chǎn)時不可避免地會與洗滌劑發(fā)生接觸，本實驗研究發(fā)現(xiàn)，陰離子洗滌劑十二烷基硫酸鈉和陽離子洗滌劑十六烷基三甲基溴化銨可顯著降低噬菌體活性，應(yīng)用時應(yīng)避免與此類洗滌劑共同使用。

綜上，本實驗所分離的噬菌體vB_SauM_RS具有作為生物抗菌劑的潛力，不僅對牛奶中金黃色葡萄球菌有良好的裂解效果，對生物被膜也有很好的清除作用，但在應(yīng)用時應(yīng)避免與陰離子或陽離子洗滌劑共同使用。