李琳瓊，洪 靜，張愛(ài)靜，王鵬杰，高瑀瓏

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023）

沙門(mén)氏菌是一種常見(jiàn)的食源性致病菌，在自然界分布廣泛、種類繁多，幾乎所有的血清型沙門(mén)氏菌都具有致病性，在全球范圍內(nèi)，由其引起的細(xì)菌性食物中毒常居食源性疾病首位[1-2]。沙門(mén)氏菌不僅威脅到人類健康，而且給食品制造業(yè)帶來(lái)巨大損失[3-5]。沙門(mén)氏菌廣泛寄生于動(dòng)物腸道內(nèi)，常常存在于新鮮的家禽肉和豬肉等肉制品中，能引起敗血癥和腸胃炎。在食品生產(chǎn)、貯藏、運(yùn)輸和銷售過(guò)程中，沙門(mén)氏菌常遭受極端的酸、堿、滲透壓、溫度、壓力以及抗菌劑等不適生長(zhǎng)條件的脅迫作用，誘發(fā)其產(chǎn)生一系列的適應(yīng)性來(lái)應(yīng)對(duì)變化的環(huán)境條件，這種適應(yīng)性包含同源性保護(hù)作用和交叉性保護(hù)作用[6-7]：如李斯特菌經(jīng)某種不利生存的因素長(zhǎng)時(shí)間脅迫后，其生存能力增強(qiáng)，這種現(xiàn)象被Hill等[8]稱為同源性保護(hù)作用；沙門(mén)氏菌遭受某種不利生存的環(huán)境脅迫后，之后在其他不利環(huán)境條件下其生存能力增強(qiáng)，這種現(xiàn)象被He Shoukui等[9]稱為交叉性保護(hù)作用。這些應(yīng)激反應(yīng)（適應(yīng)性反應(yīng)）均有助于菌體的損傷修復(fù)，能夠增強(qiáng)其抵抗后續(xù)應(yīng)激作用的能力。

環(huán)境脅迫是指環(huán)境因素接近或超過(guò)生物體、種群或群落的忍耐極限時(shí)造成的脅迫作用[10]。酸對(duì)微生物的脅迫作用一直是生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，而微生物的抗酸性受其種類、生長(zhǎng)階段和環(huán)境因素的影響[11]。在食品生產(chǎn)加工的過(guò)程中，微生物常遭受各種不適環(huán)境條件的脅迫，誘導(dǎo)出一系列自我保護(hù)機(jī)制，導(dǎo)致其對(duì)致死因素的抗性增加。其中，pH值是引起細(xì)菌細(xì)胞組成和生理變化的一個(gè)重要因素[12]。

在食品保藏過(guò)程中，有許多關(guān)于采用有機(jī)酸來(lái)控制、殺滅食源致病菌的研究報(bào)道，例如采用一定濃度的有機(jī)酸對(duì)鮮肉和蔬果等進(jìn)行噴淋、浸泡等處理來(lái)殺滅其中的致病菌[13-14]。Foster等[15]首次提出誘導(dǎo)性耐酸應(yīng)答的概念，認(rèn)為在酸脅迫條件下處于亞致死狀態(tài)的細(xì)菌經(jīng)過(guò)損傷修復(fù)之后，其生存能力會(huì)明顯增強(qiáng)。Zhang Yimin等[16]將單核增生李斯特菌置于添加了乳酸、醋酸和乙酰丙酸酸化的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)其生長(zhǎng)至穩(wěn)定期后，再經(jīng)過(guò)一定致死條件的膽鹽和酸處理后，其滅活率低于原野生對(duì)照菌株，說(shuō)明單核增生李斯特菌經(jīng)過(guò)酸處理后產(chǎn)生了抗酸性。Cebrián等[17]通過(guò)對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行亞致死濃度的酸、堿、熱和H2O2處理后，發(fā)現(xiàn)其對(duì)這些脅迫因子的抗性與原野生對(duì)照菌株相比顯著增加。Martine等[18]研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌受到酸性環(huán)境的脅迫作用后，其生理狀態(tài)會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，其中調(diào)控因子基因RpoS表達(dá)量上調(diào)并產(chǎn)生一定量的酸修復(fù)蛋白。但對(duì)于鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium）經(jīng)不同種類和不同pH值的有機(jī)酸脅迫后，是否可誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗酸性和同源性保護(hù)作用，目前尚不清楚。

食品中微生物在不適環(huán)境條件下的生長(zhǎng)和失活可通過(guò)建立微生物預(yù)測(cè)模型來(lái)對(duì)其進(jìn)行預(yù)測(cè)，為食品中微生物的控制提供科學(xué)的理論依據(jù)[19]。常用來(lái)描述微生物生長(zhǎng)和失活的動(dòng)力學(xué)模型有Linear模型[20]、Logistic模型[21]、Gompertz模型[22]、Baranyi模型[23]和Weibull模型[24]等。Linear模型操作簡(jiǎn)便，但對(duì)數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)的精確度不高；Logistic模型是數(shù)學(xué)中用來(lái)描述某一普通笛卡爾平面上S型曲線的模型，有人也將其用來(lái)研究細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，但因其不能擬合細(xì)菌延滯期的生長(zhǎng)變化，所以不能完整地顯示S型曲線；Gompertz模型和Baranyi模型克服了這些缺點(diǎn)；Baranyi模型中的參數(shù)生物學(xué)意義更明確，能夠較好地描述微生物的生長(zhǎng)曲線，目前應(yīng)用較多。Juneja等[25]使用Baranyi模型、修正Gompertz模型和Huang模型等分別建立了蠟樣芽孢桿菌在四季豆中的一級(jí)生長(zhǎng)模型，發(fā)現(xiàn)Baranyi模型為其最適生長(zhǎng)模型；Weibull模型在材料工業(yè)中常用于對(duì)脆性材料強(qiáng)度的壽命預(yù)測(cè)，也可用于研究不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)細(xì)菌失活的影響，適用于熱力殺菌[26]和非熱力殺菌[27]條件下細(xì)菌失活模型的擬合。張愛(ài)靜等[28]發(fā)現(xiàn)采用Weibull模型能較好地?cái)M合經(jīng)多次熱脅迫后產(chǎn)生抗性的大腸桿菌在80 ℃下的熱失活曲線。

本實(shí)驗(yàn)采用食品工業(yè)中常用的具有較強(qiáng)殺菌能力的檸檬酸、乙酸、乳酸和蘋(píng)果酸等有機(jī)酸處理S.typhimurium，借助Weibull模型研究經(jīng)不同有機(jī)酸誘導(dǎo)后其抗酸性的變化，以期為有機(jī)酸殺菌技術(shù)的廣泛應(yīng)用提供理論參考，對(duì)保障食品加工貯藏安全、有效控制食源性致病菌、建立食品質(zhì)量安全控制體系具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

鼠傷寒沙門(mén)氏菌（S.typhimurium）CGMCC 1.1190購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

胰蛋白胨大豆瓊脂（trypticase soy agar，TSA）培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）液體培養(yǎng)基、檸檬酸、乙酸、乳酸、蘋(píng)果酸、鹽酸、氯化鈉（均為分析純） 南京丁貝生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50FBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；GNP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱、SF-CF-2A型超凈工作臺(tái) 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；PHS-3G型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HZQ-F160型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；ME55型精密電子天平 北京塞多斯天平有限公司；SK-1型快速混勻器金壇市杰瑞爾電器有限公司；A1正置熒光顯微鏡 德國(guó)蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與預(yù)處理

供試菌經(jīng)活化后，接入pH 7.2的TSB培養(yǎng)基，于37 ℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h，后續(xù)作為對(duì)照組，備用。

1.3.2 CGMCC 1.1190抗酸菌株的獲得

不同pH值TSB培養(yǎng)基的配制：分別用濃度0.05 mol/L檸檬酸（pH 2.2）、1 mol/L醋酸（pH 2.4）、1.7 mol/L乳酸（pH 2.5）、0.07 mol/L蘋(píng)果酸（pH 2.4）調(diào)節(jié)TSB培養(yǎng)基的pH值，得到12 種pH值分別為6.2、5.2和4.2的TSB培養(yǎng)基，121 ℃、20 min滅菌，冷藏備用。強(qiáng)酸基質(zhì)培養(yǎng)基的配制：用濃度1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)TSB培養(yǎng)基至pH 2.5，滅菌備用。

酸脅迫處理：將材料中經(jīng)活化的CGMCC 1.1190菌懸液以體積分?jǐn)?shù)1%轉(zhuǎn)接至上述12 種不同pH值的TSB培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)（37 ℃、150 r/min）。對(duì)不同pH值的TSB培養(yǎng)基中CGMCC 1.1190菌株定期取樣進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，不同pH值TSB培養(yǎng)基選取不同時(shí)間間隔進(jìn)行取樣，時(shí)間間隔的選取根據(jù)CGMCC 1.1190菌株在不同pH值TSB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況決定，其生長(zhǎng)情況通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定的光密度確定。按文獻(xiàn)[29]的方法使用TSA平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。不同pH值的TSB培養(yǎng)基中CGMCC 1.1190菌株的生長(zhǎng)量通過(guò)計(jì)算每毫升TSB培養(yǎng)基中活菌的數(shù)量（CFU/mL）確定，以（lg（CFU/mL））表示。

抗酸菌株的獲得：取1.3.1節(jié)中pH 7.2的TSB培養(yǎng)基與上述12 種pH值分別為6.2、5.2、4.2的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至穩(wěn)定期的CGMCC 1.1190菌株培養(yǎng)液10 mL混合，離心（4 ℃、5 000 r/min，10 min），棄上清液，收集的沉淀用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%無(wú)菌生理鹽水洗滌兩次，再以等體積的生理鹽水制成菌懸液，分裝于無(wú)菌離心管，備用。

1.3.3 生長(zhǎng)模型的建立

采用Baranyi模型擬合CGMCC 1.1190菌株在不同種類、不同pH值的酸脅迫環(huán)境下的生長(zhǎng)曲線，建立CGMCC 1.1190菌株在不同pH值的TSB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的一級(jí)模型，菌株的生長(zhǎng)量參照公式（1）計(jì)算。

式中：t為培養(yǎng)時(shí)間/h；y（t）為t時(shí)刻CGMCC 1.1190菌株的生長(zhǎng)量（lg（CFU/mL））；y0為t＝0時(shí)CGMCC 1.1190菌株初始菌數(shù)的對(duì)數(shù)（lg（CFU/mL））；ymax為菌體最大生長(zhǎng)量的對(duì)數(shù)（lg（CFU/mL））；μmax為最大比生長(zhǎng)速率/h－1；F（t）為調(diào)整函數(shù)，表示CGMCC 1.1190菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中，從遲滯期到對(duì)數(shù)期的過(guò)渡時(shí)期（調(diào)整生理狀況和對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)期）所對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)遲滯時(shí)間。

F（t）按照公式（2）、（3）計(jì)算。

式中：v為菌體在生長(zhǎng)過(guò)程中的增長(zhǎng)速率/h－1，相當(dāng)于μmax；h0為菌體的初始生理狀態(tài)參數(shù)，用來(lái)描述其適應(yīng)新環(huán)境的能力。

式中：λ為遲滯時(shí)間/h。

1.3.4 生長(zhǎng)模型的驗(yàn)證

生長(zhǎng)模型的驗(yàn)證采用決定系數(shù)R2、準(zhǔn)確因子Af和偏差因子Bf。其中，R2表示模型的精確度和可靠性，R2越接近1，模型的擬合度越高；Af是衡量預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間的接近程度，Af越接近1，模型的擬合度越好、越精確；Bf＞1表示模型預(yù)測(cè)值比實(shí)測(cè)值高，Bf＜1表示模型預(yù)測(cè)值比實(shí)測(cè)值低，Bf越接近1，模型擬合度越高[30]。

CGMCC 1.1190菌株在經(jīng)檸檬酸、乳酸、醋酸和蘋(píng)果酸調(diào)節(jié)pH值分別至6.2、5.2和4.2的TSB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在每種pH值條件下，在不同于模型建立的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣驗(yàn)證，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。R2、Af和Bf分別按照公式（4）～（6）計(jì)算。

式中：n為測(cè)定值的個(gè)數(shù)。

1.3.5 CGMCC 1.1190菌株抗酸性的測(cè)定

利用Weibull模型來(lái)擬合CGMCC 1.1190菌株在pH 2.5的TSB培養(yǎng)基中的酸致死曲線，Weibull模型的規(guī)模參數(shù)δ/min和形態(tài)參數(shù)ρ按公式（7）計(jì)算。

式中：N0為初始CGMCC 1.1190菌數(shù)量；Nt為酸處理t時(shí)刻后存活的CGMCC 1.1190菌數(shù)量；t為酸處理時(shí)間/min。

將1.3.1節(jié)中制備的對(duì)照組和酸脅迫CGMCC 1.1190菌株生理鹽水的菌懸液分別離心（4 ℃、5 000 r/min，10 min），棄上清液，重懸于10 mL的pH 2.5 TSB培養(yǎng)基中進(jìn)行酸處理，每隔10 min取樣，于TSA培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)72 h后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，其存活率按公式（7）計(jì)算。利用Weibull模型對(duì)酸脅迫培養(yǎng)的CGMCC 1.1190菌株在pH 2.5的TSB培養(yǎng)基中的酸致死曲線進(jìn)行非線性擬合。

1.3.6 菌體形態(tài)的觀察

對(duì)1.3.1 節(jié)p H 7.2 的T S B 培 養(yǎng) 基 中 培 養(yǎng) 的CGMCC 1.1190原始對(duì)照菌種和分別經(jīng)pH 6.2、5.2和p H 4.2 的檸檬酸脅迫培養(yǎng)至穩(wěn)定期獲得的3 種CGMCC 1.1190抗酸性菌株，在TSA培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，以無(wú)菌接種環(huán)挑取單菌落，用結(jié)晶紫和碘液簡(jiǎn)單染色，顯微鏡觀察CGMCC 1.1190菌株的個(gè)體形態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)DMFit（www.combase.cc）軟件和JMP 10.0軟件進(jìn)行模型擬合，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，差異性顯著分析采用Duncan's新復(fù)極差法，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 CGMCC 1.1190菌株在不同pH值TSB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

CGMCC 1.1190菌株在pH值分別為6.2、5.2和4.2 TSB培養(yǎng)基中的Baranyi模型生長(zhǎng)曲線及其失活情況見(jiàn)圖1。

除了經(jīng)乳酸、醋酸和蘋(píng)果酸調(diào)節(jié)的pH 4.2的TSB培養(yǎng)基外，CGMCC 1.1190菌株在其他幾種不同pH值TSB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)量皆均勻地分布在生長(zhǎng)曲線兩側(cè)，說(shuō)明利用Baranyi模型能很好地?cái)M合CGMCC 1.1190菌株在pH 7.2和有機(jī)酸酸化處理后不同pH值TSB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線，CGMCC 1.1190菌株的生長(zhǎng)曲線均呈S型，擬合度較高（R2＞0.995），都有典型的延滯期、對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期，pH值越低，遲滯期越長(zhǎng)。在pH 4.2檸檬酸酸化處理的TSB培養(yǎng)基中，CGMCC 1.1190菌株的生長(zhǎng)也呈典型的S型生長(zhǎng)曲線；而在經(jīng)乳酸、醋酸和蘋(píng)果酸3 種有機(jī)酸酸化處理pH 4.2的TSB培養(yǎng)基中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，CGMCC 1.1190菌體數(shù)量快速降低，分別在12、10 h和8 h后低于檢測(cè)限，推斷其在經(jīng)乳酸、醋酸和蘋(píng)果酸3 種有機(jī)酸酸化處理pH 4.2的TSB培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)并開(kāi)始失活。與醋酸、乳酸和蘋(píng)果酸相比，CGMCC 1.1190菌株在檸檬酸酸化的TSB培養(yǎng)基中的生存能力較強(qiáng)，對(duì)檸檬酸的耐受性、抗酸性作用最強(qiáng)。

圖1 S.typhimurium CGMCC 1.1190菌株在不同pH值TSB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線及其失活情況Fig.1 Growth curves and inactivation of S.typhimurium CGMCC 1.1190 in TSB acidified at different pH

在不同pH值的TSB培養(yǎng)基中，CGMCC 1.1190菌株生長(zhǎng)的一級(jí)Baranyi模型曲線的參數(shù)估計(jì)值見(jiàn)表1。

Baranyi模型是近年來(lái)運(yùn)用廣泛的一種微生物模型[31]，其既表達(dá)了微生物生長(zhǎng)量與時(shí)間的關(guān)系，也較為準(zhǔn)確地評(píng)估微生物λ、μmax及ymax等生長(zhǎng)參數(shù)[32]。微生物生長(zhǎng)的遲滯期是指微生物接種到新的培養(yǎng)基后，由于要適應(yīng)新環(huán)境，微生物數(shù)目不會(huì)發(fā)生變化的一段時(shí)間。由表1可知，在CGMCC 1.1190菌株的生長(zhǎng)曲線中，對(duì)于同一種有機(jī)酸酸化處理的TSB培養(yǎng)基，pH值越低，λ越長(zhǎng)。CGMCC 1.1190菌株生長(zhǎng)的遲滯時(shí)間與有機(jī)酸種類有關(guān)，在pH 4.2檸檬酸酸化處理的TSB培養(yǎng)基中，CGMCC 1.1190菌株的生長(zhǎng)有典型的S型生長(zhǎng)曲線（圖1A），λ為5.32 h，而在經(jīng)乳酸、醋酸和蘋(píng)果酸酸化處理的pH 4.2的TSB培養(yǎng)基中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，CGMCC 1.1190菌株的數(shù)量明顯降低，表現(xiàn)為不生長(zhǎng)、被抑制而失活，可能是因?yàn)镃GMCC 1.1190菌體的核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜等的生物大分子物質(zhì)對(duì)這3 種酸較敏感，在酸脅迫下發(fā)生了變性，細(xì)胞的生理代謝功能急劇下降，造成菌體死亡。說(shuō)明CGMCC 1.1190菌株抗酸性的強(qiáng)弱與有機(jī)酸的種類有關(guān)，其對(duì)檸檬酸的抗性大于乳酸、醋酸和蘋(píng)果酸。

表1 S.typhimurium CGMCC 1.1190菌株生長(zhǎng)的一級(jí)Baranyi模型曲線的參數(shù)估計(jì)值Table 1 Parameter estimates of Baranyi primary model for the growth of S.typhimurium CGMCC 1.1190

在經(jīng)pH 5.2的乳酸、醋酸和蘋(píng)果酸酸化處理的TSB培養(yǎng)基中，CGMCC 1.1190菌株生長(zhǎng)的λ分別為2.32、8.45 h和8.70 h，皆明顯長(zhǎng)于經(jīng)檸檬酸酸化處理pH 5.2的TSB培養(yǎng)基中λ（1.7 h）；在經(jīng)醋酸和蘋(píng)果酸酸化處理的pH 6.2的TSB培養(yǎng)基中，λ分別為2.00 h和2.05 h，明顯長(zhǎng)于在經(jīng)檸檬酸酸化處理的pH 6.2的TSB培養(yǎng)基中的λ（1.5 h）。研究結(jié)果表明，在相同pH值條件下，CGMCC 1.1190菌株對(duì)檸檬酸產(chǎn)生的抗性最強(qiáng)。

由圖1 與表1 可知， 不同有機(jī)酸脅迫培養(yǎng)CGMCC 1.1190菌株的對(duì)數(shù)期差異顯著（P＜0.05），在經(jīng)pH 5.2檸檬酸酸化處理后，CGMCC 1.1190菌株生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期約為8 h，在經(jīng)pH 5.2的乳酸、醋酸和蘋(píng)果酸酸化處理后，對(duì)數(shù)期分別為10、16 h和16 h，表明CGMCC 1.1190菌株在不同種類的酸脅迫下的生長(zhǎng)速率不同，檸檬酸脅迫生長(zhǎng)速率最快，醋酸和蘋(píng)果酸脅迫生長(zhǎng)速率最慢；CGMCC 1.1190菌株的μmax也反映了菌體生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)不適環(huán)境抵抗能力的強(qiáng)弱，μmax越大，抵抗能力越強(qiáng)，在pH 5.2的檸檬酸、乳酸、醋酸和蘋(píng)果酸酸化處理的TSB培養(yǎng)基中，μmax分別為0.84、0.55、0.42 h－1和0.40 h－1，說(shuō)明CGMCC 1.1190菌株對(duì)這4 種酸的抵抗能力依次減小，其中，經(jīng)檸檬酸酸化處理的TSB培養(yǎng)基中μmax顯著大于在其他3 種酸化處理的μmax（P＜0.05），也說(shuō)明同一pH值下CGMCC 1.1190菌株在檸檬酸酸化處理的TSB培養(yǎng)基中抗性最強(qiáng)。

在4 種酸脅迫條件下，y0在2.12～2.72（lg（CFU/mL））之間，彼此相差小于1（lg（CFU/mL））。進(jìn)入穩(wěn)定期后，在pH 7.2和4 種有機(jī)酸調(diào)節(jié)至pH 6.2的TSB培養(yǎng)基中ymax均可達(dá)到108～109CFU/mL，無(wú)顯著性差異（P＞0.05），表明在pH 6.2時(shí)，CGMCC 1.1190菌株生長(zhǎng)所能達(dá)到的最大菌濃度并不受有機(jī)酸種類的影響。在以4 種酸分別調(diào)節(jié)至pH 5.2的TSB培養(yǎng)基中，CGMCC 1.1190菌株的ymax分別為8.57、7.87、7.82、7.77（lg（CFU/mL）），呈顯著降低趨勢(shì)（P＜0.05）；當(dāng)檸檬酸調(diào)節(jié)pH 4.2時(shí)，ymax為8.46（lg（CFU/mL）），顯著高于在經(jīng)乳酸、醋酸和蘋(píng)果酸酸化處理pH 5.2 TSB培養(yǎng)基中的ymax（P＜0.05）。結(jié)果表明，CGMCC 1.1190菌株抗酸性大小與有機(jī)酸的種類相關(guān)，其中檸檬酸＞乳酸＞醋酸＞蘋(píng)果酸。

2.2 一級(jí)Baranyi生長(zhǎng)模型的驗(yàn)證結(jié)果

CGMCC 1.1190菌株一級(jí)Baranyi模型的驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)CGMCC 1.1190菌株生長(zhǎng)的實(shí)測(cè)值及一級(jí)模型的預(yù)測(cè)值進(jìn)行相關(guān)性分析，決定系數(shù)R2＝0.999 7、Af＝1.008 3、Bf＝1.005 3，表明本實(shí)驗(yàn)建立的Baranyi模型擬合效果好，且有效、可靠，可以利用Baranyi模型對(duì)酸脅迫培養(yǎng)的CGMCC 1.1190菌株的生長(zhǎng)情況進(jìn)行預(yù)測(cè)。

表2 S.typhimurium CGMCC 1.1190菌株生長(zhǎng)一級(jí)Baranyi模型的驗(yàn)證Table 2 Validation of Baranyi model for S.typhimurium CGMCC 1.1190

2.3 抗酸性菌株在pH 2.5 TSB培養(yǎng)基中的酸致死Weibull模型曲線

1.3.2 節(jié)中經(jīng)檸檬酸、乳酸、醋酸和蘋(píng)果酸4 種有機(jī)酸調(diào)節(jié)pH值分別至6.2、5.2的TSB培養(yǎng)基中脅迫培養(yǎng)獲得的8 種抗酸性CGMCC 1.1190菌株與pH 7.2的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的對(duì)照組CGMCC 1.1190菌株，在pH 2.5 TSB培養(yǎng)基中的酸致死曲線分別見(jiàn)圖2、3。

由圖2 可知，采用W e i b u l l 模型能較好地?cái)M合CGMCC 1.1190菌株經(jīng)4 種有機(jī)酸脅迫培養(yǎng)后獲得的抗酸菌株（pH 6.2）在pH 2.5 TSB培養(yǎng)基中的失活曲線，擬合程度較高（R2＞0.991 0）。CGMCC 1.1190菌株經(jīng)酸脅迫培養(yǎng)后，再置于pH 2.5的強(qiáng)酸性環(huán)境下，隨著酸處理時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體存活率均呈下降趨勢(shì)，但與對(duì)照組相比，其存活率明顯增大，表明經(jīng)4 種有機(jī)酸酸脅迫（pH 6.2）培養(yǎng)至穩(wěn)定期的4 種CGMCC 1.1190酸脅迫菌株之間抗酸性存在差異，說(shuō)明對(duì)酸的抗性作用與脅迫培養(yǎng)的有機(jī)酸的種類相關(guān)，其中脅迫菌株抗酸性從大到小依次為檸檬酸＞乳酸＞醋酸＞蘋(píng)果酸。

圖2 pH 6.2的TSB培養(yǎng)基中脅迫培養(yǎng)獲得的S.typhimurium CGMCC 1.1190抗酸菌株在pH 2.5的TSB培養(yǎng)基中的致死曲線Fig.2 Inactivation curves of S.typhimurium CGMCC 1.1190 cultured in TSB at pH 6.2 when exposed to pH 2.5

圖3 pH5.2的TSB培養(yǎng)基中脅迫培養(yǎng)獲得的S.typhimurium CGMCC 1.1190抗酸菌株在pH 2.5的TSB培養(yǎng)基中的致死曲線Fig.3 Inactivation curves of S.typhimurium CGMCC 1.1190 cultured in TSB at pH 5.2 when exposed to pH 2.5

由圖3可知，采用Weibull模型也能較好地?cái)M合CGMCC 1.1190菌株經(jīng)4 種有機(jī)酸脅迫培養(yǎng)后獲得的抗酸菌株（pH 5.2）在pH 2.5 TSB培養(yǎng)基中的失活曲線，擬合程度較高（R2＞0.992 6）。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)4 種有機(jī)酸酸脅迫培養(yǎng)至穩(wěn)定期的4 種CGMCC 1.1190酸脅迫菌株抗酸性存在差異，這4 種CGMCC 1.1190酸脅迫菌株（pH 5.2）對(duì)pH 2.5的強(qiáng)酸的抗性大小也與有機(jī)酸的種類相關(guān)，其中脅迫菌株抗酸性從大到小依次為檸檬酸＞乳酸＞醋酸＞蘋(píng)果酸。

利用Weibull模型對(duì)本實(shí)驗(yàn)獲得的9 種CGMCC 1.1190抗酸性菌株與對(duì)照組在pH 2.5的TSB培養(yǎng)基中的致死實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，以規(guī)模參數(shù)δ來(lái)評(píng)價(jià)CGMCC 1.1190菌株的抗酸性，通過(guò)JMP軟件內(nèi)部自動(dòng)運(yùn)算所得的模型參數(shù)δ和ρ見(jiàn)表3。

表3 S.typhimurium CGMCC 1.1190抗酸性菌株在pH 2.5的TSB培養(yǎng)基中酸致死模型曲線的擬合度及參數(shù)Table 3 Fitness and parameters of inactivation models for S.typhimurium CGMCC 1.1190 cultured in medium acidified with different organic acids when exposed to pH 2.5

ρ參數(shù)代表以Weibull模型擬合CGMCC 1.1190菌株的酸致死曲線的形狀，當(dāng)ρ＝1時(shí)，曲線為直線；當(dāng)ρ＞1時(shí)，曲線向下彎曲，為凸型曲線；當(dāng)ρ＜1時(shí)，曲線向上彎曲，為凹型曲線[33]。δ表示CGMCC 1.1190菌體數(shù)量第一次減少10 倍所用的時(shí)間/min，抗酸性大小與δ成正比。隨著脅迫培養(yǎng)的pH值的降低，CGMCC 1.1190菌株的抗酸性呈上升趨勢(shì)，用檸檬酸脅迫培養(yǎng)pH值分別為6.2、5.2、4.2 TSB培養(yǎng)基中的CGMCC 1.1190菌株，δ分別為8.17、10.87 min和11.10 min，顯著大于對(duì)照組pH 7.2 TSB培養(yǎng)基中CGMCC 1.1190菌株的δ（0.51 min）（P＜0.05）。同樣，經(jīng)乳酸、醋酸和蘋(píng)果酸3 種酸脅迫培養(yǎng)后，CGMCC 1.1190菌株的δ均呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)。pH 6.2和pH 5.2檸檬酸脅培養(yǎng)的δ分別是蘋(píng)果酸脅迫培養(yǎng)的7.5 倍和6.0 倍，也表明在相同pH值下檸檬酸脅迫培養(yǎng)誘導(dǎo)CGMCC 1.1190菌株產(chǎn)生的抗酸性最強(qiáng)，蘋(píng)果酸脅迫培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗酸性最弱。經(jīng)過(guò)酸脅迫培養(yǎng)后的CGMCC 1.1190菌株比對(duì)照組菌種更加耐酸，對(duì)照組菌種于pH 2.5的TSB培養(yǎng)基中處理80 min后菌體數(shù)量下降約5.5 個(gè)對(duì)數(shù)，大部分菌體死亡，經(jīng)檸檬酸調(diào)節(jié)pH 4.2 TSB培養(yǎng)基中脅迫誘導(dǎo)培養(yǎng)的CGMCC 1.1190菌株于pH 2.5 TSB培養(yǎng)基中處理80 min后，菌體數(shù)量?jī)H下降了約2.4 個(gè)對(duì)數(shù)，CGMCC 1.1190菌株的存活率明顯提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果ρ＜1，表明CGMCC 1.1190菌株的酸致死曲線向上彎曲，為凹型曲線，進(jìn)一步說(shuō)明模型曲線隨著酸處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其下降趨勢(shì)減緩，菌株失活率下降趨勢(shì)減緩。綜上，以4 種有機(jī)酸脅迫培養(yǎng)CGMCC 1.1190菌株至穩(wěn)定期均可誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗酸性，在強(qiáng)酸作用下其致死率降低，抗酸性強(qiáng)弱與有機(jī)酸種類和pH值有關(guān)，對(duì)于同一種有機(jī)酸，pH值越低，脅迫誘導(dǎo)CGMCC 1.1190菌株產(chǎn)生的抗酸性越強(qiáng)。

2.4 檸檬酸脅迫前后CGMCC 1.1190菌株個(gè)體形態(tài)的變化

CGMCC 1.1190菌株原始對(duì)照菌種與分別經(jīng)過(guò)pH 6.2、5.2和pH 4.2檸檬酸脅迫培養(yǎng)至穩(wěn)定期獲得的3 種耐酸菌株在顯微鏡下的個(gè)體形態(tài)見(jiàn)圖4。

圖4 S.typhimuriumCGMCC 1.1190菌株個(gè)體形態(tài)圖（×1 000）Fig.4 Cellular morphology of S.typhimurium CGMCC 1.1190 (× 1 000)

CGMCC 1.1190對(duì)照菌株酸脅迫培養(yǎng)48 h后，在顯微鏡下呈單個(gè)分散狀態(tài)的短桿狀，單桿菌兩端為鈍圓（圖4A）；經(jīng)pH 6.2的檸檬酸脅迫培養(yǎng)后，個(gè)體形態(tài)略有變化，有極少數(shù)個(gè)體聚集并呈雙桿狀或八字形排列（圖4B）；經(jīng)pH 5.2的檸檬酸脅迫培養(yǎng)后，大部分菌體聚集并呈鏈狀或八字形排列（圖4C）；經(jīng)pH 4.2的檸檬酸脅迫培養(yǎng)后，幾乎全部菌體聚集并成鏈狀、柵狀或重疊狀排列（圖4D）。說(shuō)明檸檬酸的脅迫pH值越低，CGMCC 1.1190菌體的聚集狀態(tài)越明顯。個(gè)體間聚集程度的變化有助于其避免在強(qiáng)酸環(huán)境下產(chǎn)生損傷，這可能與其抗酸性能力的增加有一定的關(guān)系。劉艷霞等[34]研究發(fā)現(xiàn)，用某些藥物對(duì)雙歧桿菌作用后，其個(gè)體出現(xiàn)絲狀體生長(zhǎng)現(xiàn)象，這種個(gè)體形態(tài)的適應(yīng)性變化有利于其抵抗不適的外界環(huán)境。目前，對(duì)于CGMCC 1.1190菌株酸脅迫導(dǎo)致其抗酸能力增加的相關(guān)機(jī)理仍在研究。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)酸脅迫培養(yǎng)對(duì)S.typhimuriumCGMCC 1.1190菌株產(chǎn)生了同源性保護(hù)作用。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了S.typhimuriumCGMCC 1.1190菌株分別在經(jīng)檸檬酸、乳酸、醋酸和蘋(píng)果酸調(diào)節(jié)pH值的TSB培養(yǎng)基中脅迫培養(yǎng)，結(jié)果表明，在相同pH值條件下CGMCC 1.1190菌株的抗酸性從大到小依次為檸檬酸＞乳酸＞醋酸＞蘋(píng)果酸。篩選出經(jīng)脅迫培養(yǎng)的耐酸性菌株，發(fā)現(xiàn)在相同pH值下脅迫誘導(dǎo)，檸檬酸脅迫菌株抗酸性最強(qiáng)；對(duì)于同一種有機(jī)酸，pH值越低，脅迫培養(yǎng)誘導(dǎo)CGMCC 1.1190菌株產(chǎn)生的抗酸性越強(qiáng)，個(gè)體形態(tài)聚集程度越明顯。綜上，一定濃度的有機(jī)酸前期脅迫培養(yǎng)有利于保護(hù)CGMCC 1.1190菌株后期對(duì)強(qiáng)酸處理的同源性保護(hù)作用。