葉加蘭，呂道飛，周坪駿，許鋒，顏健，袁文兵，陳忻

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，廣東佛山 528000）

海參屬于棘皮動(dòng)物門海參綱無脊椎動(dòng)物，全球有900多種，我國(guó)約有140種，其中印度洋、西太平洋海區(qū)是世界上海參種類最多、資源量最大的區(qū)域。海參的體內(nèi)含有蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、膠質(zhì)、海參皂甙、多種微量元素和酸性黏多糖等成分，且不含有膽固醇[1-2]。

海參膠原蛋白是海參體內(nèi)含量最為豐富的活性成分，是多種海參蛋白中的主體。膠原蛋白是由多糖蛋白分子組成的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，這種獨(dú)特結(jié)構(gòu)使其具有合成高分子不具備的生物降解性、生物相容性和低抗原性，具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）活性、少黑色素生成、提高記憶力和抗疲勞等一系列重要的生物學(xué)功能[3]。

1 海參膠原蛋白的提取

從海參中提取膠原蛋白及其水解物的方法有酶法、酸法、堿法、酶與堿結(jié)合以及酶與酸結(jié)合等方法。酸解法通常需要用0.1 mol/L醋酸長(zhǎng)時(shí)間浸泡海參，并且海參的溶解量較少。蛋白酶水解膠原的優(yōu)勢(shì)主要是所需設(shè)備簡(jiǎn)單、條件溫和、反應(yīng)速率快，提取的膠原蛋白水溶性好、理化性質(zhì)穩(wěn)定、純度高等，所以酶解法制備海參膠原蛋白更為常見[4]。

任婷婷等[5]以酶解法制備海參膠原蛋白肽并優(yōu)化了制備工藝條件。以海參體壁作為實(shí)驗(yàn)原料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析對(duì)酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以木瓜蛋白酶為水解酶，添加底物濃度5.5%、酶解溫度控制67.8 ℃、pH值6.7、酶添加量2 500 U/g、控制酶解時(shí)間為4 h，在此條件下，海參膠原蛋白肽的水解度為17.76%，所得海參膠原蛋白肽的制備工藝條件最佳。

陳卉卉等[6]以東海海參為原料，選取木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶以及復(fù)合酶（木瓜-風(fēng)味）提取海參膠原蛋白，以自由基清除率為指標(biāo)，在其最佳水解條件下水解，確定了海參蛋白多肽清除自由基最優(yōu)條件是使用木瓜蛋白酶水解4 h，清除率可達(dá)70%以上；多肽清除超氧自由基及羥自由基的IC50分別為49.3 mg/mL和27.8 mg/mL。

梁杰等[7]以海參為原料制備海參蛋白多肽，以水解度和羥自由基清除率為指標(biāo)，從木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶中篩選出最適酶。確定以堿性蛋白酶制備海參蛋白多肽水解度明顯高于其他蛋白酶，酶添加量4%，酶解時(shí)間3.0 h，酶解溫度55 ℃，pH值8.0為最佳工藝條件，通過最優(yōu)工藝參數(shù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到羥基自由基清除率為63.75%。

高楊[8]通過均勻?qū)嶒?yàn)確定了海參體壁酸溶性膠原蛋白提取的最佳條件為料液比1∶1 000（g/mL）、乙酸濃度0.5 mol/L、提取時(shí)間72 h，在此條件下得率為7.35%。通過紅外吸收光譜以及紫外吸收光譜譜圖鑒定可知，所提取的海參體壁酸溶性膠原蛋白純度較高，保持著完整的三股螺旋構(gòu)型；通過氨基酸分析可知其氨基酸組成類似于Ⅰ型膠原。

2 海參蛋白的生物活性

海參膠原蛋白不僅具有美容養(yǎng)顏、延緩衰老、增強(qiáng)免疫力、改善記憶等膠原蛋白常見功效，其富含的海參多糖、海參皂甙等營(yíng)養(yǎng)成分也有益于人體健康，與組織的形成、成熟、細(xì)胞間的信息傳遞有著密切的關(guān)系。

趙芹等[9]表明，冰島刺參膠原蛋白多肽對(duì)經(jīng)過H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的損傷具有顯著保護(hù)作用，其中低分子量的蛋白多肽的效果更佳。研究中采用H2O2誘導(dǎo)高分化PC12細(xì)胞建立氧化損傷神經(jīng)細(xì)胞模型，將細(xì)胞分成正常對(duì)照組、模型對(duì)照組（H2O2）和樣品保護(hù)組（膠原蛋白多肽+H2O2），先采用冰島刺參膠原蛋白多肽C1和C2處理細(xì)胞后，加入H2O2損傷細(xì)胞。分別以甲基偶氮唑鹽（MTT）法測(cè)定PC12細(xì)胞的增殖活性，采用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平、丙二醛含量、細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶和Caspase-3的活性及培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶的釋放量。當(dāng)劑量大于50 μg/mL時(shí)，C1和C2均可顯著提高由H2O2誘導(dǎo)損傷的PC12的增殖活性。高劑量組的細(xì)胞中活性氧水平均顯著降低，中、高劑量組細(xì)胞的乳酸脫氫酶釋放量和丙二醛活力均顯著升高，各組細(xì)胞凋亡因子Caspase-3的活性顯著下降。

宋佳佳等[10]以海參為原料，以羥自由基（·OH）清除能力、Fe2+螯合能力和Fe3+還原能力為指標(biāo)，在試驗(yàn)中以H2O2刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞建立氧化損傷細(xì)胞模型，研究其蛋白肽的體外抗氧化活性和對(duì)H2O2誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)效果和作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，海參蛋白肽能夠清除·OH自由基，具有Fe3+還原能力和Fe2+螯合能力，且其體外抗氧化能力呈現(xiàn)出濃度依賴效應(yīng)。海參蛋白肽能提高氧化損傷細(xì)胞活力，也可以顯著降低氧化損傷RAW264.7巨噬細(xì)胞活性氧水平，顯著提高巨噬細(xì)胞內(nèi)血紅素氧合酶-1的mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，海參蛋白肽是通過上調(diào)RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)血紅素氧合酶-1的mRNA的表達(dá)水平發(fā)揮對(duì)巨噬細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。

趙芹等[11]采用氧化型低密度脂蛋白處理血管內(nèi)皮細(xì)胞建立氧化應(yīng)激損傷模型，觀察北極刺參膠原蛋白多肽及革皮氏海參這兩種蛋白肽對(duì)氧化型低密度脂蛋白損傷的血管內(nèi)皮胞的保護(hù)作用，結(jié)果表明經(jīng)由2種海參膠原蛋白多肽預(yù)處理后，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖率、細(xì)胞一氧化氮合酶活力和NO釋放量均顯著升高，細(xì)胞凋亡比率、丙二醛含量顯著降低和凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)量均顯著降低。可見，2種海參膠原蛋白多肽對(duì)經(jīng)脂質(zhì)過氧化物損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞均有保護(hù)能力。

3 結(jié)語(yǔ)

近年來，海參養(yǎng)殖業(yè)在我國(guó)蓬勃的發(fā)展，其營(yíng)養(yǎng)成分和活性功效備受專家學(xué)者的關(guān)注。海參中的活性物質(zhì)有脂肪、維生素、膠質(zhì)、蛋白質(zhì)、海參皂甙、多種微量元素和酸性黏多糖等成分，其中蛋白質(zhì)含量最為豐富，蛋白質(zhì)中又以膠原蛋白為主。海參膠原蛋白除了具有美容養(yǎng)顏、延緩衰老、增強(qiáng)免疫力、改善記憶等膠原蛋白常見功效，其蛋白肽小分子對(duì)人體損傷細(xì)胞還具有顯著的保護(hù)作用。