龐 延，盧健棋，朱智德，溫志浩，梁逸強(qiáng)，韓景波，彭志林，林 浩

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是一種冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺血缺氧引起心肌壞死的急危病癥，雖然通過(guò)藥物治療、搭橋手術(shù)以及支架置入等有效干預(yù)治療措施取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，但是在損傷心肌的功能恢復(fù)方面仍存在一定局限，預(yù)后不夠理想。研究提示干細(xì)胞移植在治療缺血性心臟病中具有巨大潛力，內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell，EPCs)能夠通過(guò)分泌各種血管生成因子以及直接分化為內(nèi)皮細(xì)胞，遷移到損傷部位并形成新的血管而改善心功能，但由于移植的EPCs在損傷組織中存活率較低，其臨床試驗(yàn)結(jié)果并不令人滿意。因此，尋找一種保護(hù)和促進(jìn)移植EPCs發(fā)揮最大效能的藥物具有重要意義[1-2]。前期研究表明，養(yǎng)心通脈方含藥血清能夠明顯促進(jìn)AMI兔骨髓EPCs增殖、遷移和黏附能力，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)被認(rèn)為是調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、活化和分化的重要因素之一[3-4]。本研究主要通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討?zhàn)B心通脈方含藥血清預(yù)處理EPCs對(duì)AMI兔心肌bFGF、VEGF水平的影響，以期為中醫(yī)藥聯(lián)合干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病提供一定臨床思路和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性家兔39只，體質(zhì)量2.0～2.2 kg，12周齡，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(桂)2009-0002。

1.2 藥物、試劑及儀器 養(yǎng)心通脈方組成：紅參、麥冬、五味子、當(dāng)歸、川芎、白術(shù)、桂枝、炙甘草各10 g，黃芪、白芍、丹參各15 g，木香、檀香各3 g，購(gòu)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，TRIzol Reagent(天根公司生產(chǎn)，批號(hào)DP424)，戊巴比妥鈉 (Serve，批號(hào)：201505)，兔骨髓淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)蠊旧a(chǎn)，批號(hào)：2013LRA)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS，維森特公司生產(chǎn)，批號(hào)：311-010-CL)，熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)試劑盒(Genecopies，AOPR-1200)，人纖維連接蛋白(HFN，美國(guó) Roche生產(chǎn)，批號(hào)：1105140700)，焦碳酸二乙酯(DEPC，Vetec生產(chǎn)，V900882)，胎牛血清 (FBS，Hyclone生產(chǎn)，批號(hào):SV30087.01)，EPCs專用培養(yǎng)基 (EGM-2，Lonza生產(chǎn)，批號(hào)：CC-3202)，蛋白酶抑制劑混合物(弗德生物生產(chǎn)，F(xiàn)D1002)，BCA蛋白定量試劑盒(弗德生物生產(chǎn)，F(xiàn)D2001)，RIPA裂解液(弗德生物生產(chǎn)，F(xiàn)D008)，熒光定量PCR儀(ABI公司生產(chǎn)，貨號(hào)7500)，微量核酸定量?jī)x(Merinton公司生產(chǎn)，SMA4000)，小動(dòng)物呼吸機(jī)(CKENTSCIENTIFIC ORPORATION公司生產(chǎn)，型號(hào)：RSP-1002)，EGC-6511型心電圖機(jī)(上海光電醫(yī)用電子儀器廠)等。

1.3 養(yǎng)心通脈方含藥血清預(yù)處理EPCs培養(yǎng)液的制備 4只家兔取1只制備含藥血清，含藥血清組給予養(yǎng)心通脈方灌胃，參照《藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算》換算給藥量為8 mL /(kg·d)[5]，每日2次，連續(xù)5 d，末次給藥后無(wú)菌取血離心分離血清，滅活后備用。取3只家兔麻醉后從股骨干抽取骨髓組織，離心和洗滌獲取單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，以含10%FBS的EGM-2培養(yǎng)基接種到預(yù)先處理的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)至第20天的EPCs用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 使細(xì)胞同步化，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個(gè)/mL，將10%養(yǎng)心通脈方含藥血清置入含10%FBS的EGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)96 h制成養(yǎng)心通脈方含藥血清預(yù)處理EPCs培養(yǎng)液[3]。

1.4 方法

1.4.1 AMI兔模型建立 SPF級(jí)健康雄性家兔腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，氣管插管后連接小型動(dòng)物呼吸機(jī)機(jī)械輔助通氣，連接肢體導(dǎo)聯(lián)觀察心電圖，行左側(cè)胸廓切開(kāi)術(shù)后撕開(kāi)心包膜暴露心臟，找到左心耳位置，強(qiáng)光下暴露動(dòng)脈血管，用7.0聚丙烯縫線于右室流出道和左心耳之間結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支中上1/3處，心電圖可見(jiàn)ST段抬高，左心室心肌顏色逐漸由粉紅色變暗蒼白，將心臟回納入胸腔，關(guān)胸后分別對(duì)肌層和皮層進(jìn)行縫合，術(shù)后予青霉素抗感染。

1.4.2 家兔實(shí)驗(yàn)分組 將35只雄性SPF級(jí)兔隨機(jī)選取5只家兔作為正常組，不做處理；隨機(jī)選取5只家兔作為假手術(shù)組，只開(kāi)胸穿線，不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支；其余25只家兔進(jìn)行AMI造模，造模成功后隨機(jī)分為模型組、養(yǎng)心通脈方含藥血清預(yù)處理EPCs心肌注射組(中藥EPCs心肌注射組)、EPCs心肌注射組、養(yǎng)心通脈方含藥血清預(yù)處理EPCs耳緣靜脈注射組(中藥EPCs耳緣靜脈注射組)、EPCs耳緣靜脈注射組，每組5只。

1.4.3 各組干預(yù)及細(xì)胞移植方法 正常組、假手術(shù)組、模型組不予干預(yù)；中藥EPCs心肌注射組：將養(yǎng)心通脈方含藥血清預(yù)處理的EPCs細(xì)胞混懸液濃度調(diào)整為8×105/mL，在建立AMI模型手術(shù)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈15 min后，再次打開(kāi)胸腔，分別于結(jié)扎區(qū)附近心肌組織分5點(diǎn)注射濃度為8×105/mL的養(yǎng)心通脈方含藥血清預(yù)處理的EPCs細(xì)胞混懸液250 μL后關(guān)閉胸腔；EPCs心肌注射組：在建立AMI模型手術(shù)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈15 min后，再次打開(kāi)胸腔，分別于結(jié)扎區(qū)附近心肌組織分5點(diǎn)注射EPCs培養(yǎng)液1 mL后關(guān)閉胸腔；中藥EPCs耳緣靜脈注射組：建立AMI家兔模型后即刻從耳緣靜脈注射濃度為1×107/mL的養(yǎng)心通脈方含藥血清預(yù)處理的EPCs細(xì)胞混懸液；EPCs耳緣靜脈注射組：建立AMI家兔模型后即刻從耳緣靜脈注射EPCs培養(yǎng)液1 mL。術(shù)后2周處死各組家兔取心肌組織進(jìn)行PCR、蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 PCR檢測(cè)bFGF、VEGF的mRNA表達(dá) 提取總RNA，擴(kuò)增mRNA，再逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，熒光定量 PCR 法檢測(cè)bFGF、VEGF表達(dá)。引物合成由廣州四和生物科技有限公司合成。VEGF引物序列：正向引物GCCGAGAAAGAGAAAAAGTG，反向引物GAGAGAGAGCAGGAGATACA，片段長(zhǎng)度為163 bp；bFGF引物序列：正向引物GGAAGATGGACGGCTGCTGG，反向引物CGTTTCAGTGCCACATACCAA，片段長(zhǎng)度為162 bp；Atcb(內(nèi)參)引物序列：正向引物CTTCTAGGCGGACTGTTAGA，反向引物CCTTCACCGTTCCAGTTTTT，片段長(zhǎng)度為179 bp。采用2-△△Ct法進(jìn)行各基因表達(dá)的相對(duì)定量。

1.5.2 Western Blot檢測(cè)bFGF、VEGF蛋白表達(dá) 提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒等試劑進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，經(jīng)上樣→電泳→轉(zhuǎn)膜→免疫反應(yīng)→化學(xué)發(fā)光顯色等處理后，利用Image J軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶。

2 結(jié) 果

2.1 各組缺血心肌及梗死心肌區(qū)bFGF、VEGF mRNA表達(dá)比較 在梗死心肌區(qū)及缺血心肌區(qū)，中藥EPCs心肌注射組和中藥EPCs耳緣靜脈注射組bFGF、VEGF mRNA 表達(dá)明顯高于假手術(shù)組、模型組、EPCs心肌注射組、EPCs耳緣靜脈注射組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但中藥EPCs心肌注射組bFGF、VEGF mRNA 表達(dá)與中藥EPCs耳緣靜脈注射組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，EPCs心肌注射組bFGF、VEGF mRNA 表達(dá)與EPCs耳緣靜脈注射組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組術(shù)后2周不同心肌組織bFGF、VEGF mRNA 表達(dá)比較(±s)

2.2 各組缺血心肌及梗死心肌區(qū)bFGF、VEGF蛋白表達(dá)比較 在梗死心肌區(qū)及缺血心肌區(qū)，中藥EPCs心肌注射組、中藥EPCs耳緣靜脈注射組bFGF、VEGF蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組、模型組、EPCs心肌注射組、EPCs耳緣靜脈注射組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但中藥EPCs心肌注射組bFGF、VEGF蛋白表達(dá)與中藥EPCs耳緣靜脈注射組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，EPCs心肌注射組bFGF、VEGF 蛋白表達(dá)與EPCs耳緣靜脈注射組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，各組缺血心肌區(qū)bFGF、VEGF蛋白表達(dá)高于梗死心肌區(qū)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組術(shù)后2周不同心肌組織bFGF、VEGF蛋白表達(dá)比較(±s)

3 討 論

AMI后心肌細(xì)胞大量壞死是預(yù)后不良的主要原因之一，長(zhǎng)期以來(lái)，人們普遍認(rèn)為，一旦心肌細(xì)胞死亡，幾乎無(wú)再生能力，然而，越來(lái)越多的證據(jù)表明，即使在梗死區(qū)也存在具有修復(fù)和促進(jìn)心肌再生作用的祖細(xì)胞，但在缺乏最佳氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的情況下，新生心肌細(xì)胞存活率很低[6]。大量基礎(chǔ)研究及臨床研究提示，在損傷組心肌區(qū)移植干細(xì)胞不僅能夠分化產(chǎn)生有功能的新生心肌細(xì)胞，還可分化成內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種促血管生成分子，促進(jìn)干細(xì)胞歸巢，參與血管生成而改善損傷心肌血運(yùn)重建并抑制心臟重塑過(guò)程，提示干細(xì)胞移植在未來(lái)輔助治療AMI中的可行性[7]。

EPCs于1997年在人外周血液中被發(fā)現(xiàn)，是一種對(duì)缺血信號(hào)極為敏感的干細(xì)胞，能夠在缺血早期迅速向缺血部位歸巢，產(chǎn)生大量的血管生成細(xì)胞因子及促進(jìn)原位細(xì)胞增殖，通過(guò)整合蛋白激酶B(Akt)通路、內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)傳導(dǎo)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1等信號(hào)通路，并激活以及分泌VEGF在內(nèi)的多種生長(zhǎng)因子發(fā)揮保護(hù)和修復(fù)損傷組織的作用，如bFGF、VEGF等細(xì)胞生長(zhǎng)因子，由于移植的EPCs面臨著損傷組織低氧濃度、炎癥反應(yīng)等復(fù)雜環(huán)境，移植的EPCs在臨床試驗(yàn)中的結(jié)果并不令人滿意，通過(guò)EPCs預(yù)處理來(lái)保護(hù)EPCs活性可能是治療缺血性心臟病有效的治療策略，相關(guān)研究提示，逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒等介導(dǎo)的基因傳遞系統(tǒng)及使用兩種細(xì)胞組合移植被證明具有明顯提高細(xì)胞存活率和增強(qiáng)細(xì)胞功能，但天然化合物很容易從動(dòng)物或植物分離，并且副作用更少，使之更具有優(yōu)勢(shì)，如褐藻和褐藻的提取物巖藻聚糖預(yù)處理EPCs能夠明顯減弱EPCs衰老和增強(qiáng)缺血組織的體內(nèi)細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活，雷公藤堿能促進(jìn)EPCs遷移、增殖能力等[2，8-9]。

養(yǎng)心通脈方是我院全國(guó)名老中醫(yī)李錫光教授治療冠心病的常用方，其療效肯定，沿用至今。本研究結(jié)果提示，養(yǎng)心通脈方預(yù)處理EPCs移植治療能夠明顯增加AMI兔損傷心肌bFGF、VEGF表達(dá)，損傷心肌處移植與耳緣靜脈注射移植兩種干預(yù)方式并無(wú)明顯差異。由于本研究樣本量較小，干預(yù)時(shí)間短，缺少短期及遠(yuǎn)期療效評(píng)價(jià)，仍需進(jìn)行多基因、多蛋白、多通路的深入研究，同時(shí)進(jìn)行遠(yuǎn)期療效對(duì)比以及中藥復(fù)方藥理學(xué)交叉探討其主要作用機(jī)制，以期為中醫(yī)藥預(yù)處理干細(xì)胞移植治療AMI提供更為準(zhǔn)確的研究證據(jù)。