李超，孫艷華

（河北省滄州市人民醫(yī)院，河北 滄州）

0 引言

結(jié)、直腸惡性腫瘤，在醫(yī)院中比較常見(jiàn)，它一種消化道腫瘤。有研究發(fā)現(xiàn)，在全球惡性腫瘤的發(fā)病率中，結(jié)、直腸惡性腫瘤名列前三。在人群中有相對(duì)較高的發(fā)病率，對(duì)人們的生命健康造成極大的危害，且近年來(lái)，其發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)[1]。隨著臨床上對(duì)結(jié)、直腸惡性腫瘤研究的逐漸加深，發(fā)現(xiàn)結(jié)、直腸惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制之一就是表觀遺傳學(xué)。在該學(xué)說(shuō)中，DNA甲基化為上述機(jī)制之一，腫瘤的發(fā)生于基因的異常表達(dá)緊密相關(guān)[2]。近期研究發(fā)現(xiàn)，SOX30基因是受甲基化調(diào)控的新腫瘤抑制基因，在腫瘤的發(fā)生中，SOX30基因能通過(guò)調(diào)控一系列與細(xì)胞凋零、增殖的相關(guān)信號(hào)通路而參與其中，有研究發(fā)現(xiàn)，肺癌的發(fā)生也與SOX30基因的失活密切相關(guān)[3]。為了進(jìn)一步明確SOX30在其他腫瘤的發(fā)生中的參與情況，本研究就結(jié)直腸癌細(xì)胞中SOX30基因的甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析探究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 資料與方法

選取我院于2018年12月至2019年12月整理的結(jié)直腸癌組織石蠟標(biāo)本60例及12例癌旁組織進(jìn)行分析，這些標(biāo)本的采集均來(lái)自于于我院進(jìn)行大腸癌切除術(shù)的大腸癌組織標(biāo)本，同時(shí)切除了12例癌組織旁5 cm以上的正常組織作為癌旁組織標(biāo)本。其中有男32例、女28例，年齡為34～65歲，平均為（48.58±5.48）歲。腫瘤分型如下：結(jié)腸鱗癌10例、結(jié)腸腺癌35例以及直腸腺癌15例。根據(jù)結(jié)腸癌TNM分期，有Ⅰ期13例、Ⅱ期40例以及Ⅲ期7例。

1.2 方法

對(duì)所有采集的標(biāo)本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)、去甲基化實(shí)驗(yàn)以及甲基化特異性PCR檢測(cè)以及BSP分析，具體方法如下。逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)：采用Trizol法將3種結(jié)、直腸惡性腫瘤細(xì)胞株中的總RNA分別提取出來(lái)，取總數(shù)，共計(jì)2 μg，將提取出的RNA放入RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并取其模板1 μL，并分別將1 μL的SOX30基因上游引物與1 μL的下游引物、β-actin內(nèi)參基因上游引物1 μL、與下游引物1 μL下加入其中，最后進(jìn)行TaqDNA聚合酶擴(kuò)增。去甲基化實(shí)驗(yàn)：選取甲基化藥物5-氮雜-2-脫氧胞苷10 μmol/mL，將細(xì)胞進(jìn)行處理，于實(shí)驗(yàn)72 h后收集細(xì)胞，將總RNA提取出來(lái)，對(duì)細(xì)胞SOX30基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。甲基化體異性PCR及硫化測(cè)序PCR：采用FFPE DNA Kit DNA提取試劑盒，將結(jié)、直腸惡性腫瘤組織細(xì)胞株DNA提出。采用EZ DNA Methylation Kit對(duì)提出的DNA加工修飾，于溫度為-20 ℃下進(jìn)行保存。選1 μL硫化DNA樣本以及0.5 μL的甲基化上下游引物，同樣將TaqDNA聚合酶加入，進(jìn)行MSP擴(kuò)增。

1.3 觀察標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)標(biāo)本的情況，對(duì)比不同年齡段（超過(guò)50歲以及低于50歲）、不同性別、不同腫瘤病理分型以及TNM分期的SOX30基因甲基化差異[4]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

兩組對(duì)比數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件分析、處理，用（%）對(duì)計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行表示，并用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量數(shù)據(jù)以（）表示，t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SOX30基因在結(jié)、直腸惡性腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)情況、甲基化情況以及mRNA表達(dá)情況

據(jù)研究結(jié)果，與對(duì)照組比較，可以發(fā)現(xiàn)在HCT116、HCT8Y、SW480惡性腫瘤細(xì)胞株中，SOX30基因調(diào)控的mRNA水平都表達(dá)較低。在上述細(xì)胞株中，SOX30的甲基化發(fā)生率較高，因此，高甲基化狀態(tài)與SOX30基因出現(xiàn)低表達(dá)情況具有相關(guān)性，在進(jìn)行去甲基化實(shí)驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)在以上3株細(xì)胞株中，明確存在SOX30基因調(diào)控的mRNA表達(dá)水平出現(xiàn)增強(qiáng)，說(shuō)明在以上惡性腫瘤細(xì)胞株中，SOX30mRNA是甲基化的沉默基因。

2.2 人結(jié)直癌組織的甲基化情況

利用MSP法對(duì)60例結(jié)、直腸惡性腫瘤組織及12例腫瘤旁組織樣本進(jìn)行檢測(cè)，觀察到60例結(jié)、直腸惡性腫瘤組織中，SOX30基因檢測(cè)出甲基化發(fā)生率為78.33%（47/60），在癌旁組織中為16.67%（2/12），表明在結(jié)、直腸惡性腫瘤組織中，出現(xiàn)SOX30甲基化的情況較多。

2.3 相關(guān)性分析

患者的年齡、性別、TNM分期與SOX30基因甲基化發(fā)生不存在內(nèi)在相關(guān)性（P>0.05），同其所患惡性腫瘤的病理分型明顯相關(guān)，見(jiàn)表1。

表1 分析SOX30基因甲基化發(fā)生率相關(guān)性因素（n, %）

3 討論

SOX基因家族是由SRY相關(guān)基因所構(gòu)成的一大類，編碼SOX的轉(zhuǎn)錄因子。這類基因除了決定性別、分化、參與早期發(fā)育，有研究發(fā)現(xiàn)，該基因?qū)τ谀[瘤的發(fā)生作用重大[5]。隨著臨床上對(duì)SOX基因研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其家族中一個(gè)基因，即SOX2，當(dāng)其高表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)患者的腫瘤浸潤(rùn)深度相對(duì)較低，且其發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率也很低。當(dāng)其在胃惡性腫瘤患者中高表達(dá)時(shí)，臨床觀察到其預(yù)后效果通常較好。此外，還有一些研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌以及胰腺癌中，SOX17基因與SOX7基因均存在較高水平的甲基化率而出現(xiàn)失活，表明SOX基因與相關(guān)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中起到了十分重要的作用[6]。在1999年SOX家族中迎來(lái)了新的一員。De Mrtino等人發(fā)現(xiàn)了SOX30基因?；谇拜厒兿绕诘囊恍┫嚓P(guān)研究。SOX30被證實(shí)為一種抑癌基因，它通過(guò)調(diào)控p53基因水平，起到誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，從而實(shí)現(xiàn)其重要抑癌功能，由此推測(cè)，該基因極有可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色。

利用MSP法對(duì)60例結(jié)、直腸惡性腫瘤組織及12例腫瘤旁組織樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)60例結(jié)、直腸惡性腫瘤組織中SOX30基因檢測(cè)出甲基化發(fā)生率為78.33%（47/60），在癌旁組織中為16.67%（2/12），明顯比結(jié)、直腸惡性腫瘤組織的發(fā)生率低，提示在結(jié)直腸惡性腫瘤組織中，出現(xiàn)SOX30基因甲基化的情況較多。根據(jù)研究結(jié)果，與對(duì)照組比較，可以發(fā)現(xiàn)在HCT116、HCT8Y、SW480惡性腫瘤細(xì)胞株中，SOX30基因調(diào)控的mRNA水平都表達(dá)較低。在上述細(xì)胞株中，SOX30的甲基化發(fā)生率較高，因此，高甲基化狀態(tài)與SOX30基因出現(xiàn)低表達(dá)情況具有相關(guān)性，在進(jìn)行去甲基化實(shí)驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)在以上3株細(xì)胞株中，明確存在SOX30基因調(diào)控的mRNA表達(dá)水平出現(xiàn)增強(qiáng)，說(shuō)明在以上惡性腫瘤細(xì)胞株中，SOX30mRNA是甲基化的沉默基因。在結(jié)、直腸惡性腫瘤中，該基因呈現(xiàn)出了抑癌基因的表現(xiàn)，但相關(guān)機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，在結(jié)、直腸惡性腫瘤的演變過(guò)程中，SOX30基因通過(guò)高甲基化失活或下調(diào)，就會(huì)導(dǎo)致其抑癌基因作用失去，而參與結(jié)、直腸惡性腫瘤的發(fā)生。臨床上將SOX30基因的甲基化作為潛在結(jié)、直腸惡性腫瘤標(biāo)志物，具有較高的臨床意義。