宋國(guó)欣，張家新,2*，王瑞軍,3，張美娜，李金泉,2,3*

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉羊遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)山羊遺傳育種工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

海藻糖作為非滲透性二糖，其作用原理是通過(guò)增加稀釋液的表面張力以及穩(wěn)定質(zhì)膜來(lái)保護(hù)細(xì)胞，這是由于海藻糖可以與細(xì)胞膜磷脂的磷脂極性頭基直接相互作用[1]。海藻糖通過(guò)自身抗氧化作用清除冷凍過(guò)程產(chǎn)生的活性氧（ROS），減少脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)（LPO），提高精子冷凍保存效果[2]。海藻糖對(duì)精子的保護(hù)作用可能優(yōu)于其他糖類(lèi)（葡萄糖、蔗糖），目前已在牛[3]、山羊[4]、綿羊[5]、貓[6]、豬[7]等多個(gè)物種上證明了海藻糖的積極作用。

甘油作為滲透性冷凍保護(hù)劑，它通過(guò)滲透到細(xì)胞內(nèi)插入脂質(zhì)雙分子層，改變細(xì)胞質(zhì)粘度、改變水分子的擴(kuò)散速率、抑制冰晶形成等方式穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)[8]。海藻糖和甘油兩者共同作用可以防止冰晶形成，穩(wěn)定精子膜的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，增加精子冷凍時(shí)的脫水速度以及膜流動(dòng)性[9]。因此在精子冷凍過(guò)程中聯(lián)合補(bǔ)充海藻糖和甘油的作用效果優(yōu)于單獨(dú)添加某一種冷凍保護(hù)劑。

盡管可以預(yù)期甘油和海藻糖之間的協(xié)同作用會(huì)提高精子冷凍保存效果，但兩者特性不同，對(duì)精子的保護(hù)方式存在差異[10]。因此，本研究旨在檢驗(yàn)冷凍稀釋中不同濃度海藻糖和甘油對(duì)精子冷凍解凍后的綜合參數(shù)，探究海藻糖和甘油協(xié)同作用對(duì)絨山羊精子冷凍保存的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Tris、檸檬酸、葡萄糖、海藻糖、甘油均購(gòu)于Sigma 公司，雙抗購(gòu)于Gibco 公司，AnnaxinV/PI 試劑盒購(gòu)于BD 生物技術(shù)公司，PNA-TITC 購(gòu)于上海哈靈生物技術(shù)公司，吖啶橙（A8120）、SOD（NAT 法）檢測(cè)試劑盒、DCFH-DA（S0033）和Fluo-3AM 檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司，MAT 脂質(zhì)過(guò)氧化試劑盒購(gòu)于北京索萊寶生物有限公司。

1.2 精液采集 精液采自6 只（1.5～2 歲）健康且具有正常繁殖性能的內(nèi)蒙古絨山羊種公羊。利用假陰道法采集精液并進(jìn)行鮮精品質(zhì)檢測(cè)和冷凍前處理工作。用于精液冷凍保存精液應(yīng)達(dá)以下標(biāo)準(zhǔn)：精液射精量在1～2 mL，最低密度2×109個(gè)/mL，精子活力在80% 以上。為消除個(gè)體差異，將精液在37℃下進(jìn)行混合。

1.3 冷凍稀釋液配制 本實(shí)驗(yàn)使用的基礎(chǔ)稀釋液為300 mmol/L Tris，95 mmol/L 檸檬酸－水合物、56 mmol/L葡萄糖、1% 雙抗（v/v）、10% 卵黃（v/v）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在基礎(chǔ)稀釋液上添加不同濃度的海藻糖0 mmol/L（T0）、50 mmol/L（T50）（海藻糖濃度為實(shí)驗(yàn)前自行篩選得到最適濃度），以及0%（G0）、1%（G1）、2%（G2）、3%（G3）的甘油。將配制好的稀釋液用0.22 μm濾器過(guò)濾混勻，4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 精液冷凍 將混合后鮮精分為8 等份，分別與含有不同濃度甘油和海藻糖的稀釋液以1:5 的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋。將混合后精液置于4℃冰箱內(nèi)，以0.2℃/min 緩慢降溫至4℃后裝入0.25 mL 冷凍細(xì)管，封管后繼續(xù)平衡30 min。平衡后冷凍細(xì)管放置在自制熏蒸架上，置于距液氮4 cm 處熏蒸7 min，投入液氮中冷凍保存。冷凍保存1 周后進(jìn)行解凍，解凍時(shí)，將冷凍細(xì)管投入38℃水浴中30 s[11]。

1.5 精子質(zhì)量檢測(cè)

1.5.1 精子運(yùn)動(dòng)檢測(cè) 取10 μL 解凍后精子于精子分析儀專(zhuān)用載玻片上，利用精子分析儀輔助分析系統(tǒng)（Computer-Assisted Sperm Analysis System-CASA，日本）分別檢測(cè)解凍后精子活力和精子運(yùn)動(dòng)速率，其中精子運(yùn)動(dòng)速率包括直線運(yùn)動(dòng)速率（VSL）、曲線運(yùn)動(dòng)速率（VCL）以及平均路徑速度（VAP）。

1.5.2 精子結(jié)構(gòu)檢測(cè) 將解凍后的精液，加入適量PBS，1 000 r/min 離心3 min 進(jìn)行洗滌，棄上清后利用PBS 重懸，調(diào)整精子密度為1.2×107。按照PNA-FITC試劑盒說(shuō)明操作染色30 min 后洗滌，加入10 μL PI 染色5 min，洗滌，最終利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行精子頂體完整率檢測(cè)。流式細(xì)胞儀（ACEA Novo Cyte TM）檢測(cè)時(shí)，設(shè)置參數(shù)采集2 萬(wàn)個(gè)精子細(xì)胞。PNA-FITC/PI 染色后，統(tǒng)計(jì)Q2-3（PI-PNA-），為完整頂體的精子比率。在上述精子密度下，按照Annaxin V/PI 試劑盒說(shuō)明對(duì)精子進(jìn)行染色檢測(cè)精子膜的完整性，染色20 min 后利用PBS 洗滌，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。流式細(xì)胞儀檢測(cè)2 萬(wàn)個(gè)精子細(xì)胞數(shù)，Annaxin V/PI 染色后，統(tǒng)計(jì)Q2-3（PI-Annexin -V-）為完整質(zhì)膜的精子比率。在上述精子密度下，利用DNA 凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行操作，10 μmol/L 吖啶橙染液避光染色15 min。染色后，流式細(xì)胞儀分析精子DNA 完整比率。

1.6 精子中總超氧化物歧化酶和丙二醛含量檢測(cè) 冰浴預(yù)冷后的PBS 對(duì)解凍后精子進(jìn)行洗滌，沉淀的精子細(xì)胞冰浴勻漿后4℃離心，取上清備用。利用總超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，按照說(shuō)明書(shū)要求配制檢測(cè)液，按說(shuō)明書(shū)將檢測(cè)液和樣品加到96 孔板，孵育5～10 min。隨后用酶標(biāo)儀在560 nm 下檢測(cè)吸光值，每個(gè)樣品設(shè)置3 組空白對(duì)照，利用總SOD 含量公式進(jìn)行計(jì)算。樣品總SOD 含量=[（A空白對(duì)照1-A空白對(duì)照2）-（A樣品-A空白對(duì)照3）]/（A空白對(duì)照1-A空白對(duì)照2）。

丙二醛（MDA）含量檢測(cè)：將解凍后精液利用PBS 洗滌后去上清，加入MDA 提取裂解液，冰浴超聲破碎后，12 000 r/min 離心10 min，取上清。利用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，用酶標(biāo)儀繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度,以下蛋白濃度用Cpr 表示。按照說(shuō)明書(shū)要求對(duì)MDA 含量進(jìn)行測(cè)定，將待測(cè)樣品與MDA 檢測(cè)工作液混勻；將混合液99℃水浴保溫30 min 后冰浴冷卻，10 000 r/min 離心10 min，吸取上清，多功能酶標(biāo)儀測(cè)定A450、A532、A600 的吸光值。MDA（nmol/mg prot）=5×[12.9×（A532-A600）-2.58×A450]/ Cpr。

1.7 精子中ROS 和Ca2+水平檢測(cè) 將解凍后的精液加入適量PBS 洗滌，1 000 r/min 離心3 min，棄上清，調(diào)整精子密度為1.2×107/mL。用ROS 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ROS 水平，洗滌后的精子加入1 mL 不含卵黃和甘油的稀釋液，加入10 μmol/L DCFH-DA，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱避光孵育30 min，每隔5 min 輕輕顛倒混勻后PBS洗滌3 次后重懸，取200 μL 待測(cè)液進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)其熒光值，熒光強(qiáng)度=熒光值A(chǔ)（DCFH-DA）-熒光值B（細(xì)胞自發(fā)光）。

檢測(cè)精子細(xì)胞中游離的Ca2+水平，洗滌后的精子加入PBS 懸浮調(diào)整濃度為1.2×107/mL，加入5 μmol/L Fluo-3AM，37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱避光孵育60 min，離心去上清，加入PBS 懸浮繼續(xù)孵育30 min，洗滌2 次，PBS 重懸，取200 μL 用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其熒光值，其中,熒光強(qiáng)度=熒光值A(chǔ)（Fluo-3AM）-熒光值B（細(xì)胞自發(fā)光）。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 采用SAS9.0 軟件進(jìn)行存在交互作用雙因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 海藻糖甘油協(xié)同作用對(duì)精子冷凍-解凍后運(yùn)動(dòng)性能的影響 如圖1 所示，T50G1 組精子活力顯著高于其他各組，T0G0 組和T50G0 組的精子活力顯著低于其他各組。存在甘油時(shí)，T0 組，解凍后精子活力隨著甘油濃度的升高而升高；而T50 組，解凍后精子活力隨著所添加甘油濃度的升高而降低（圖1-A）。在速率檢測(cè)中，T50G1 組的VCL、VSL、VAP 均顯著高于其他各組，而T0G0 組和T50G0 組的VCL、VSL 和VAP 顯著低于其他各組。T50G2、T50G3、T0G3 組VCL 水平差異不顯著（圖1-B）。

圖1 絨山羊精子解凍后活力（A）和速率（B）

2.2 海藻糖甘油協(xié)同作用對(duì)絨山羊精子冷凍-解凍后DNA 完整率、頂體完整率和質(zhì)膜完整率的影響 由圖2 可知，T50G1 和T50G2 組DNA 完整率顯著高于其他各組且兩組之間差異不顯著。T0G0 組和T50G0 組DNA完整率顯著低于其他各組，DNA 完整率在70%左右。T50G1 組頂體以及質(zhì)膜完整率顯著高于其他各組，T0G0組顯著低于其他各組。存在甘油時(shí)，T0 組解凍后精子完整質(zhì)膜比率隨著甘油濃度的升高而升高；T50 組，解凍后精子質(zhì)膜完整率隨著所添加甘油濃度的升高而降低。

2.3 海藻糖甘油協(xié)同作用對(duì)絨山羊精子中SOD 和MDA含量的影響 如圖3-A 所示，T50G1 組和T50G2 組冷凍-解凍后精子細(xì)胞中總SOD 水平顯著高于其他各組，T0G0 組顯著低于其他各組。如圖3-B 所示，T0G0 組精子中MDA 含量顯著高于其他各組，T50G1、T50G2、T50G3 組顯著低于其他各組，但這3 組之間差異不顯著。

2.4 海藻糖甘油協(xié)同作用對(duì)絨山羊精子中ROS 和Ca2+水平的影響 利用DCFH-DA 對(duì)解凍后絨山羊精子中ROS 進(jìn)行特異性染色后，利用流式細(xì)胞儀對(duì)其熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)分析，其中檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度越高證明精子中ROS 水平越高。如圖4-A 可知，T0G0 組ROS 水平極顯著高于其他各組，T50G1 組和T50G2 組極顯著低于其他各組，但兩組之間差異不顯著。Fluo 3-AM 對(duì)冷凍-解凍后Ca2+進(jìn)行特異性染色，其中熒光強(qiáng)度越高，精子中Ca2+水平越高。如圖4-B 所示，T0G0 組熒光強(qiáng)度極顯著高于其他各組，T50G1 組極顯著低于其他各組，T50G1 組極顯著低于其他各組。

3 討 論

凍融過(guò)程對(duì)精子細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能造成損害，導(dǎo)致冰晶形成、滲透失衡、氧化應(yīng)激使精子活力以及受精能力下降[12]。研究表明，可以通過(guò)向冷凍稀釋液中添加某些可以減少冰晶形成、維持滲透平衡以及抵御氧化應(yīng)激的物質(zhì)提高精子冷凍保存效果[13]。

海藻糖是精子冷凍保存中常用的冷凍保護(hù)劑，同時(shí)海藻糖還具有一定的抗氧化能力，對(duì)山羊精子冷凍保存起到積極作用[14]。本研究結(jié)果顯示，添加50 mmol/L 海藻糖更有利于精子保存，提高精子活力，維持精子結(jié)構(gòu)完整性。并且海藻糖可以通過(guò)提高SOD 含量、降低MDA 水平、降低Ca2+內(nèi)流、減少 ROS產(chǎn)生，從而提高精子抗氧化能力，提高解凍后精子品質(zhì)。Aisen 等[15]和Bispo 等[16]在山羊精子冷凍保存研究中，將精子保存于添加100 mmol/L 海藻糖的冷凍稀釋液中，冷凍-解凍后精子活力以及結(jié)構(gòu)完整性顯著高于其他組別。Zhu 等[2]研究證明，在兔精液冷凍保存過(guò)程中添加100 mmol/L 海藻糖可以通過(guò)提高精子中SOD 含量、降低ROS 水平進(jìn)而提高精子活力和品質(zhì)，其中海藻糖添加量的不同可能是冷凍方式或者物種不同所導(dǎo)致，但與本研究結(jié)果相同，這說(shuō)明海藻糖在維持冷凍-解凍后山羊精子的活力、速率和細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性以及提高精子抗氧化能力具有重要作用。

圖2 冷凍解凍后精子的頂體完整性、質(zhì)膜完整性和DNA 完整性分析

甘油作為山羊精液冷凍保存常用滲透性冷凍保護(hù)劑，添加量一般在3%～5%，高濃度甘油對(duì)精子具有毒害作用[17]。在常溫下，甘油會(huì)損傷精子頂體和頸部，造成尾部彎曲，破壞某些酶類(lèi)，從而影響受精率[18]，并導(dǎo)致精子細(xì)胞骨架中肌動(dòng)蛋白絲的解聚[19]。生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)中為防止甘油對(duì)精子的毒性作用，通常利用非滲透性冷凍保護(hù)劑（如蔗糖和海藻糖）代替甘油或者減少甘油添加量，以改善解凍后精子質(zhì)量[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，添加50 mmol/L 海藻糖時(shí)，1%甘油可以在保護(hù)精子的同時(shí)可對(duì)精子的毒性降到最低。這一結(jié)果與Athurupana 等[20]研究結(jié)果接近，即利用100 mmol/L 海藻糖完全替代甘油，可提高豬精子冷凍保存效果。但在本研究中，海藻糖不能夠完全替代甘油，這可能是由于山羊和豬精子質(zhì)膜組成不同。

圖3 解凍后精子總SOD 及MDA 含量

圖4 DCFH-DA 和Fluo 3-AM 熒光強(qiáng)度分析

本研究中，海藻糖和甘油聯(lián)合使用的效果顯著優(yōu)于單獨(dú)添加海藻糖或者單獨(dú)添加甘油，證明兩者之間通過(guò)相互協(xié)同的方式發(fā)揮作用。T50G1 組活力顯著高于其他各組，50 mmol/L 海藻糖和1%甘油聯(lián)合作用時(shí)解凍后精子活力最高，在70% 左右。除此之外，海藻糖和甘油的協(xié)同作用對(duì)精子活力和膜完整性具有一定的濃度依賴(lài)性。存在甘油時(shí)，添加海藻糖組精子活力和質(zhì)膜完整性隨著甘油濃度的升高而降低，T50G1 高于T50G3 組。而未添加海藻糖組恰恰相反，精子活力和質(zhì)膜完整性隨著甘油濃度的升高而降低，T0G1 組低于T0G3 組。但在精子的頂體完整率和抗氧化性能等其他指標(biāo)上并不存在這一規(guī)律。

目前，海藻糖和甘油互作機(jī)制尚未明確，但可以通過(guò)現(xiàn)有的研究及結(jié)果進(jìn)行推測(cè)。海藻糖和甘油對(duì)精子的保護(hù)方式上存在差異，兩者可能是通過(guò)互補(bǔ)的方式協(xié)同保護(hù)精子質(zhì)膜完整性，從而提高精子活力[21]。本實(shí)驗(yàn)可以證實(shí)這一假設(shè)，海藻糖和甘油聯(lián)合互作會(huì)顯著提高精子活力、膜完整性等相關(guān)指標(biāo)，其作用結(jié)果顯著優(yōu)于不添加海藻糖或甘油的各組。海藻糖和甘油對(duì)精子膜完整性的作用存在一定規(guī)律，主要可能因?yàn)楫?dāng)僅存在甘油時(shí)，精子只能依賴(lài)甘油來(lái)抵御冷凍損傷，較高濃度的甘油更容易發(fā)揮保護(hù)作用，提高精子活力；而當(dāng)存在海藻糖時(shí)，海藻糖和甘油共同抵御冷凍損傷，所需甘油濃度下降，高濃度甘油反而會(huì)損傷精子質(zhì)膜，降低精子活力。

海藻糖和甘油通過(guò)協(xié)同作用提高絨山羊精子冷凍保存質(zhì)量，這一結(jié)果與Najafi 等[22]基于大豆卵磷脂（SL）稀釋液上聯(lián)合添加海藻糖和甘油對(duì)山羊精子的影響結(jié)果一致。海藻糖發(fā)揮非滲透保護(hù)作用，甘油發(fā)揮滲透性冷凍保護(hù)作用，兩者通過(guò)彼此互補(bǔ)發(fā)揮自身優(yōu)勢(shì)，充分保護(hù)精子膜完整，提高膜流動(dòng)性從而提高精子活力和品質(zhì)。同時(shí)海藻糖具有抗氧化作用，通過(guò)增加SOD 含量、降低 ROS 水平等方式提高精子抗氧化能力，提高精子冷凍保存效果[23]。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，在絨山羊精液冷凍保存過(guò)程中，海藻糖和甘油通過(guò)濃度相互協(xié)同作用提高精子冷凍保存效果。其中當(dāng)海藻糖濃度為50 mmol/L、甘油濃度為1%時(shí)，取得最佳的精子冷凍保存效果。