惠茂茂，周志楠，敖 葉，唐 文，洪 磊，陳 祥*

（1.貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550025；2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025）

黔北麻羊是貴州三大地方山羊品種之一[1]，屬短毛皮肉兼用品種，具有適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖率高、產(chǎn)肉性能良好等優(yōu)點(diǎn)[2]。四跨膜蛋白超家族（TM4ST）是一組分子量在20～50 ku 的細(xì)胞膜蛋白[3]。CD81S屬于四跨膜蛋白超家族，是細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳遞的重要橋梁。根據(jù)自身具有的黏附效應(yīng)，CD81在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。聶青和[4]研究發(fā)現(xiàn)在不同孕期胎盤絨毛組織中CD81基因的表達(dá)量不相同。據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，CD81基因參與卵泡發(fā)育及排卵的調(diào)控過程[5]。此外，CD81基因也在大腦發(fā)育[6]、神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞的介導(dǎo)[7]、丙型肝炎病毒（HCV）感染[8]等方面也發(fā)揮相當(dāng)大的作用。

趨化因子是一類目前為止數(shù)量最多、具有趨化吸引性的蛋白分子，在腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移有著重要作用[9]。CCL26基因是趨化因子中的一類，在嗜酸性粒細(xì)胞表面表達(dá)量最高[10-11]。有研究表明，趨化因子CCL26基因與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移有重要關(guān)聯(lián)[12]。趨化因子對(duì)妊娠也影響甚大。在子宮內(nèi)膜被侵入滋養(yǎng)細(xì)胞過程中趨化因子可促血管生成因子，直接影響胎盤發(fā)育[13]。目前CCL26基因與動(dòng)物繁殖性能的相關(guān)研究較少。本實(shí)驗(yàn)旨在探究趨化因子對(duì)動(dòng)物性腺細(xì)胞的直接或間接影響表達(dá)，以單、多羔黔北麻羊?yàn)檠芯繉?duì)象，通過檢測(cè)CD81、CCL26基因在組織中的差異表達(dá)量，為進(jìn)一步探討2 個(gè)基因?qū)ι窖蚍敝车挠绊懱峁┗A(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由貴州省習(xí)水縣富興畜牧業(yè)開發(fā)有限公司提供6 只健康單、多羔黔北麻羊母羊，進(jìn)行屠宰后分別采取下丘腦、垂體、子宮、輸卵管和卵巢5 個(gè)部分性腺組織，液氮保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 TRIzol@Reagent 試劑盒購(gòu)自貴州綠盟英創(chuàng)生物科技有限公司；熒光定量試劑q-PCR Mix 購(gòu)自擎科生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 移液槍：德國(guó)Eppendprf 公司；紫外可見分光光度計(jì)，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 有限公司；電泳儀（DYY-2C 型），購(gòu)自北京市六一儀器廠；PCR 擴(kuò)增儀（C1000 TouchTM）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（型號(hào)為CFX96 Real-Time System）、凝膠成像系統(tǒng)（Universal Hood Ⅱ），均購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD 有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank 公布的山羊CD81基因序列（登錄號(hào)： NM_001285676.1）；CCL26基因序列（登錄號(hào)：XM_005697796.3）利用Primer Premier 5.0 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，將β-actin作為內(nèi)參基因。設(shè)計(jì)引物后交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)股份有限公司合成。引物基本信息見表1。

表1 黔北麻羊CD81、CCL26 引物信息

1.4.2 RNA 的提取 根據(jù)TRIzol@Reagent 試劑盒說明書分別提取下丘腦、垂體、子宮、輸卵管、卵巢5 個(gè)組織中RNA。并用超微量分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度，將峰圖單一、曲線平滑、OD260/OD280比值在1.8～2.0 的RNA 保存于-80℃冰箱，用于后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 cDNA 的合成 采用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈。反轉(zhuǎn)錄體系的體積為20 μL：dNTP mix（2.5 mmol/L Each） 4 μL，Primer mix 2 μL，RNA 模板2 μL，5×RT Buffer 4 μL，DTT（0.1 mol/L） 2 μL，HiFi Script 1 μL，RNase-Free ddH2O 5 μL。PCR 反應(yīng)條 件為42℃孵育50 min，85℃孵育5 min 于-20℃冰箱保存。

1.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量q-PCR 10 μL 反應(yīng)體系：cDNA 模板1 μL，SYBR Premix Ex Taq TM 酶（2×）5.5 μL，上、下游引物（10μmol/μL）各0.5 μL，ddH2O 2.5 μL。q-PCR程序：95℃預(yù)變性 1 min，95℃變性15 s，退火15 s，60℃延伸32 s，39 個(gè)循環(huán)，熔解曲線由機(jī)器自動(dòng)設(shè)置，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3 個(gè)重復(fù)并設(shè)置陰性對(duì)照。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)分析利用2-ΔΔCt相對(duì)定量法[14]計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。使用SPSS 23.0 軟件中One-Way ANOVA 進(jìn)行單因素方差分析，使用LSD 法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果采用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差來表示，P＜0.05 為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，以P＜0.01 作為差異極顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1CD81、CCL26基因的擴(kuò)增黔北麻羊CD81、CCL26基因擴(kuò)增結(jié)果如圖1 所示。經(jīng)過PCR 擴(kuò)增，CD81基因大小為129 bp，CCL26基因大小為167 bp。與預(yù)測(cè)片段大小一致，且條帶清晰、單一，無非特異性擴(kuò)增，證明目的基因CD81、CCL26熒光定量引物特異性良好，可做下一步實(shí)驗(yàn)研究。

圖1 CD81（A）、CCL26（B）基因擴(kuò)增圖像

2.2CD81、CCL26基因在黔北麻羊單、多羔不同性腺中表達(dá)分析

2.2.1CD81基因在黔北麻羊單、多羔不同組織的表達(dá)分析 如圖2 所示，CD81基因在黔北麻羊單、多羔5 個(gè)組織中均有不同程度表達(dá)。在單羔組內(nèi)，CD81基因在卵巢中的表達(dá)量最高，其次為輸卵管、垂體、下丘腦，在子宮中的表達(dá)量最低；在卵巢中的表達(dá)量極顯著高于其他組織；垂體、輸卵管表達(dá)量極顯著高于下丘腦、子宮。在多羔組內(nèi)，CD81基因在卵巢中的表達(dá)量最高，其次為垂體、子宮、輸卵管，在下丘腦中的表達(dá)量最低；卵巢表達(dá)量極顯著高于其他組織；垂體與輸卵管、下丘腦表達(dá)量差異極顯著。CD81基因mRNA 在子宮多羔組中的表達(dá)量顯著高于單羔組，其余組間無顯著差異。

圖2 CD81 基因在黔北麻羊單、多羔不同組織中的表達(dá)

2.2.2CCL26基因在黔北麻羊、多單羔不同組織的表達(dá)分析 如圖3 所示，CCL26基因在黔北麻羊單、多羔不同組織的表達(dá)量各不同。單、多羔組均在卵巢組織表達(dá)量最高，下丘腦表達(dá)量最低；單羔中各組織的表達(dá)量普遍高于多羔。單羔組內(nèi)，CCL26基因在卵巢、輸卵管和子宮的表達(dá)量極顯著高于下丘腦和垂體表達(dá)量。多羔組內(nèi)，CCL26基因在卵巢、輸卵管組織表達(dá)量極顯著高于下丘腦、垂體、子宮，在垂體、下丘腦、子宮間差異不顯著。CCL26基因在單羔組子宮的表達(dá)量極顯著高于多羔組；在單羔組輸卵管和卵巢的表達(dá)量顯著高于多羔組。

3 討 論

圖3 CCL26 基因在黔北麻羊單、多羔不同組織中的表達(dá)

3.1 各組織中CD81基因表達(dá)量的變化情況CD81是機(jī)體內(nèi)分布廣泛、參與各種生理應(yīng)答的跨膜蛋白分子，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗原呈遞、細(xì)胞融合等機(jī)制中發(fā)揮重要作用，目前對(duì)于這一基因的研究越來越廣泛[15]。有研究證明慢性肝病的發(fā)生是由于丙型肝炎病毒（HCV）感染導(dǎo)致的，其中CD81基因直接或間接參與了整個(gè)病毒感染機(jī)制的發(fā)生[16]。Rubinstein 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠卵母細(xì)胞表面，CD81基因與富含跨膜蛋白的膜相關(guān)聯(lián)，缺乏CD81基因會(huì)導(dǎo)致小鼠雌性的生育能力缺陷。湯繼順等[18]對(duì)小尾寒羊和蘇尼特羊進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，CD81基因在14 種組織中均有高表達(dá)，小尾寒羊性腺組織中下丘腦表達(dá)量最高，蘇尼特羊卵巢表達(dá)量最高，在精卵質(zhì)膜融合過程中起重要作用。何柳等[19]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CD81基因除了在性腺組織中高表達(dá)外，還在以獼猴為模型的肝臟、脾臟淋巴結(jié)等組織中顯著表達(dá)。Ohnami 等[20]通過小鼠免疫細(xì)胞化學(xué)分析表明，CD81廣泛分布在卵母細(xì)胞細(xì)胞膜外，參與精子卵母細(xì)胞的融合。Jankovicova 等[21]在比較豬和牛卵母細(xì)胞中CD81的定位過程中發(fā)現(xiàn)，此基因在卵母細(xì)胞成熟和胚胎早期發(fā)育過程能夠高度表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CD81基因在黔北麻羊單多羔中都有表達(dá)，CD81基因在單多羔卵巢組織表達(dá)量最高，且均極顯著高于其他組織，這與相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果[17-18,20]一致。據(jù)相關(guān)研究證明，CD81基因的過表達(dá)可提高小鼠的受精率[22]。因此可以推斷，山羊的繁殖力與CD81基因有著重要關(guān)聯(lián)，尤其是卵巢組織中。CD81基因參與山羊精卵融合相關(guān)的機(jī)制推測(cè)還需進(jìn)一步證實(shí)。

3.2 各組織中CCL26基因表達(dá)量的變化情況CCL26作為嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子，通過CCR3受體發(fā)出信號(hào)[23]，而CCR3除了在嗜酸性粒細(xì)胞表達(dá)外，還在絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞、合胞體滋養(yǎng)細(xì)胞和EVT 等表達(dá)[24]。由此猜測(cè)CCL26對(duì)于滋養(yǎng)層細(xì)胞有作用。Chau Simon 等[25]證明了CCL26在子宮中高表達(dá)，調(diào)節(jié)子宮蛻膜螺旋小動(dòng)脈的重塑過程，影響妊娠過程。Dominguez 等[26]從原代上皮子宮內(nèi)膜細(xì)胞收集的條件培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)CCL26的存在，表達(dá)量極高。

EoE 患者的活檢物中CCL26表達(dá)顯著增加，并且單核苷酸多態(tài)性與疾病發(fā)病率增加相關(guān)[27]。Caselli 等[28]在女性原發(fā)特異性不孕的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞上CCL26基因表達(dá)量升高。還有實(shí)驗(yàn)證明CCL26基因在發(fā)情周期的第0、3、7 天在子宮內(nèi)膜中表達(dá)且第0天表達(dá)量最高[29]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在黔北麻羊性腺組織中CCL26的表達(dá)量不同，在卵巢中表達(dá)量最高，下丘腦表達(dá)量最低，垂體、子宮、卵巢表達(dá)量居中。目前CCL26基因引發(fā)炎癥反應(yīng)的研究居多，而在性腺組織的相關(guān)性研究較少，尤其是在動(dòng)物為模型的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)CCL26基因子宮也在山羊中高表達(dá)，與Chau Simon 等[25]、Dominguez 等[26]研究結(jié)果一致。通過CCL26在性腺組織中的表達(dá)量高低推測(cè)CCL26可能調(diào)控山羊的繁殖，但具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

通過對(duì)黔北麻羊下丘腦、垂體、子宮、輸卵管、卵巢5 個(gè)組織CD81和CCL26基因的熒光定量分析，表明2 種基因在山羊單多羔中都有不同表達(dá)，在卵巢中表達(dá)量最高；CD81在單羔下丘腦組織、雙羔下丘腦組織表達(dá)量最低，CCL26在單多羔下丘腦組織表達(dá)量最低。CCL26基因在單羔組子宮的表達(dá)量極顯著高于多羔組。結(jié)果證明2 種基因可能影響性腺發(fā)育，參與山羊繁殖調(diào)控，為進(jìn)一步研究基因功能提供依據(jù)。