唐善花 周徐 于學(xué)波 曹丹 唐亮 郭琳娜 黃珊娜

（1 海軍軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室 上海 200438）

（2 上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院麻醉科 上海 200127）

（3 海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院病理科 上海 200438）

細(xì)胞移植是治療肝病的有效手段之一，目前在肝衰竭和代謝性肝病臨床應(yīng)用中具有較為突出的治療效果?，F(xiàn)階段全世界有近百位的患者進(jìn)行了肝細(xì)胞治療，大部分患者臨床癥狀得到改善或者成功接受肝移植[1]。盡管短期療效顯著，肝細(xì)胞移植臨床應(yīng)用的最大挑戰(zhàn)在于細(xì)胞移植后再生效率問(wèn)題。細(xì)胞在體內(nèi)的再生主要是細(xì)胞與周圍環(huán)境共同作用的結(jié)果。而肝臟微環(huán)境主要由非實(shí)質(zhì)細(xì)胞及其分泌因子構(gòu)成，Kupffer 細(xì)胞是肝臟內(nèi)主要的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞來(lái)源，其數(shù)量占肝臟細(xì)胞總體數(shù)量的15%，同時(shí)具備多樣的生物學(xué)功能，參與肝臟正常合成代謝、肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展等過(guò)程[2]。目前Kupffer 細(xì)胞在肝臟再生過(guò)程中的作用仍然存在較大的爭(zhēng)議，有研究人員在肝切的模型中證明清除Kupffer 細(xì)胞后會(huì)延遲肝再生的過(guò)程[3]，也有人證明清除Kupffer 細(xì)胞后加速肝再生的過(guò)程[4]。體內(nèi)肝再生的過(guò)程往往伴隨著肝損傷，然而沒(méi)有研究深入探討Kupffer 細(xì)胞是否對(duì)肝損傷及肝細(xì)胞移植的效率有所影響。本研究采用Fah-/-小鼠模型模擬肝損傷及肝細(xì)胞移植過(guò)程，通過(guò)觀察Fah-/-小鼠撤藥后肝損傷過(guò)程中巨噬細(xì)胞的活化情況，并采用巨噬細(xì)胞清除或與肝細(xì)胞共同回輸?shù)姆绞竭M(jìn)行肝再生效率以及病理學(xué)變化評(píng)價(jià)。

1.材料與方法

1.1 材料

Fah-/-小鼠（129S4 品系，體重20 ～25g，10 周齡，63 只），F(xiàn)ah-/-小鼠受贈(zèng)于第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部細(xì)胞生物學(xué)教研室，繁育于第二軍醫(yī)大學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)前在此小鼠飲用水中加入7.5mg/L NTBC（4-對(duì)羥苯丙酮酸二氧合酶活性抑制劑）維持小鼠正常生存。野生型小鼠（體重20 ～25g，129S4 品系，10 周齡）6 只，均正常進(jìn)食。

1.2 動(dòng)物分組與處理

9 只Fah-/-小鼠用于NTBC 藥物撤除后觀察肝損傷與巨噬細(xì)胞活化過(guò)程（3 只/時(shí)間點(diǎn)）；10 只Fah-/-小鼠用于驗(yàn)證脂質(zhì)體清除巨噬細(xì)胞效果實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)組n=5，對(duì)照組n=5）；30 只Fah-/-小鼠用于巨噬細(xì)胞清除后肝細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)（10 只/時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組n=5，對(duì)照組n=5），細(xì)胞移植后對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組均撤除NTBC 藥物；4 只Fah-/-小鼠用于骨髓巨噬細(xì)胞的體外分離與培養(yǎng)；10 只Fah-/-小鼠用于巨噬細(xì)胞與肝細(xì)胞共同移植實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)組n=5，對(duì)照組n=5），細(xì)胞移植后對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組均撤除NTBC 藥物；6 只野生型129S4 品系小鼠用于原代肝細(xì)胞的分離。

1.3 原代肝細(xì)胞分離與移植

采用原位兩步灌流法與梯度密度離心法分離獲得單個(gè)原代肝細(xì)胞后，采用臺(tái)盼藍(lán)染色法對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行活率檢測(cè)，使細(xì)胞活率在80%以上；采用Hank's 液將細(xì)胞洗滌2 遍，離心參數(shù)50xg，5min；最后重懸于William's E 培養(yǎng)基中，肝細(xì)胞懸液密度調(diào)整為5×105/ml。將小鼠麻醉后，經(jīng)小鼠肋下開(kāi)口暴露脾臟，采用脾臟注射移植細(xì)胞，每只小鼠移植體積為200μl 左右的肝細(xì)胞懸液，肝細(xì)胞數(shù)目為1×105/只。對(duì)照組注射200μl 的William's E 培養(yǎng)基。

1.4 小鼠巨噬細(xì)胞分離與培養(yǎng)

將小鼠兩側(cè)后肢股骨進(jìn)行體外分離，再剔除骨頭上多余的結(jié)締組織以及肌肉，用于防止其他組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞混入。用刀片切除股骨兩頭，1ml 注射器吸入1640 完全培養(yǎng)基（10% FBS，1%青-鏈霉素），從股骨的一段進(jìn)行反復(fù)推注，直至骨髓沖洗完全。收集培養(yǎng)皿中細(xì)胞懸液，以40ng/ml 的濃度比例添加GM-CSF 細(xì)胞因子，刺激骨髓中單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。經(jīng)過(guò)12H 的培養(yǎng)后，收集未貼壁的細(xì)胞，重新將細(xì)胞接種入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每隔2 ～3d 換液1 次。

1.5 統(tǒng)計(jì)處理

再殖效率的評(píng)價(jià)采用Image J 軟件分析；其余數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 7 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用雙尾非配對(duì)t檢驗(yàn)用于計(jì)算兩組平均值之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 Fah 基因剔除小鼠撤藥后肝臟損傷的同時(shí)伴隨著巨噬細(xì)胞的活化

Fah-/-小鼠是Grompe 等模仿人類遺傳型酪氨酸血癥I 型（hereditary tyrosinaemia type I，HTl）建立的模型小鼠。該小鼠由于Fah 基因的缺失，酪氨酸分解代謝受阻，導(dǎo)致酪氨酸中間代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的蓄積，從而引肝臟損傷。NTBC[2-（2-硝基-4-三氟甲基苯甲?；?環(huán)己烷-1，3-二酮]可通過(guò)阻斷有害物質(zhì)的生成從而維持Fah-/-小鼠的生存與肝功能。撤除NTBC 藥物后1 周、2 周、3 周，H&E 染色顯示小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)逐漸紊亂，并且出現(xiàn)局灶性壞死。免疫組化F4/80 染色結(jié)果顯示，在此過(guò)程中伴隨著巨噬細(xì)胞數(shù)目的增加（圖1）。

圖1 Fah 基因缺陷小鼠肝損傷的同時(shí)伴隨著巨噬細(xì)胞的活化

2.2 清除巨噬細(xì)胞有利于提高肝細(xì)胞移植的重建效率

脂質(zhì)體清除巨噬細(xì)胞的效率約為50%（圖2A）。清除巨噬細(xì)胞后進(jìn)行肝細(xì)胞移植，分別在1 周、2 周和4 周時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察。免疫組化Fah 染色與統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示，在細(xì)胞移植后前2 周，對(duì)照組與清除巨噬細(xì)胞組沒(méi)有顯著差異，而第4 周時(shí)清除巨噬細(xì)胞組定植細(xì)胞的克隆數(shù)目與大小明顯多于對(duì)照組（圖2C，D）。這說(shuō)明巨噬細(xì)胞影響肝細(xì)胞的定植與再植。

圖2 清除巨噬細(xì)胞有利于提高肝細(xì)胞移植的重建效率

2.3 Fah-/-小鼠骨髓巨噬細(xì)胞與肝細(xì)胞共同回輸不利于肝細(xì)胞的體內(nèi)增殖

將Fah-/-小鼠骨髓來(lái)源的單核細(xì)胞進(jìn)行體外分離與培養(yǎng)，并在GMSF 生長(zhǎng)因子的刺激下將其定向分化為巨噬細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定，經(jīng)體外培養(yǎng)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞（F4/80+/CD11b+）純度為99.15%（圖3A，B）。將巨噬細(xì)胞與新鮮分離的原代肝細(xì)胞按1:5的比例混合，共同移植入Fah-/-小鼠脾臟中。5 周后免疫組化染色及統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示，巨噬細(xì)胞與原代肝細(xì)胞混合組，肝臟重建比例明顯降低，肝損傷也更為嚴(yán)重（圖3C，D）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞與原代肝細(xì)胞混合注射組的小鼠脾臟中，巨噬細(xì)胞特異標(biāo)志物F4/80+細(xì)胞的數(shù)量明顯多于對(duì)照組（圖3E），由此我們認(rèn)為巨噬細(xì)胞影響肝細(xì)胞移植過(guò)程中細(xì)胞在體內(nèi)的增殖過(guò)程。

圖3 巨噬細(xì)胞與肝細(xì)胞回輸不利于肝細(xì)胞的體內(nèi)增殖

3.討論

肝臟具有十分強(qiáng)大的再生功能，不管是急性還是慢性肝損傷中均存在肝細(xì)胞的再生。在急性肝損傷中，由各類非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，如肝星狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌的促肝再生信號(hào)分子，如IL-6、HGF 等分子會(huì)刺激肝細(xì)胞在短期內(nèi)快速大量增殖，補(bǔ)充損失的肝細(xì)胞從而實(shí)現(xiàn)再生[2，5-6]，然而，在慢性肝臟損傷進(jìn)程中，存在大量的炎性因子浸潤(rùn)及其相關(guān)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控體系，如TNF-alpha 信號(hào)通路、FGF7、HGF 及EGF 等信號(hào)分子，這些信號(hào)可以促進(jìn)肝前體細(xì)胞（liver progenitor cells，LPCs）的增生[7-9]。因此在體內(nèi)，細(xì)胞實(shí)現(xiàn)增殖再生的過(guò)程實(shí)際上是由細(xì)胞與所處微環(huán)境共同作用的結(jié)果[10]。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了巨噬細(xì)胞妨礙了肝細(xì)胞移植中肝再生的過(guò)程。然而本次研究沒(méi)有探討巨噬細(xì)胞通過(guò)何種機(jī)制阻礙了外源細(xì)胞的增殖過(guò)程，比如巨噬

細(xì)胞的吞噬作用或者分泌因子起到了潛在的關(guān)鍵作用，又或者不同亞群的巨噬細(xì)胞對(duì)于肝細(xì)胞移植效率的影響有可能有差異。研究巨噬細(xì)胞在肝再生過(guò)程中的作用有助于幫助我們重新認(rèn)識(shí)肝臟再生的過(guò)程，解決肝細(xì)胞移植臨床應(yīng)用的難題，本次研究有可能為臨床肝細(xì)胞移植提供新的策略和參考。