吳方南，李 卓，田振軍*

（1.陜西師范大學(xué) 體育學(xué)院暨運(yùn)動(dòng)生物學(xué)研究所，陜西 西安 710119；2.西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，陜西 西安 710049）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是危害人類生命健康的嚴(yán)重疾病之一，MI后心肌出現(xiàn)缺血缺氧和炎癥反應(yīng)，心臟梗死區(qū)出現(xiàn)缺血性壞死，伴隨心肌細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致心功能明顯下降（Jinatongthai et al.，2017；Reed et al.，2017）。心梗的預(yù)防和康復(fù)手段是國(guó)內(nèi)外臨床醫(yī)師和學(xué)者們高度關(guān)注的問(wèn)題。臨床研究發(fā)現(xiàn)，適宜的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練改善MI心臟心功能，降低心肌梗死的復(fù)發(fā)率及死亡率（Asaria et al.，2017）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練抑制心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管新生并減緩心肌纖維化，增強(qiáng)大鼠心功能（Cai et al.，2018；Xi et al.，2016），因此，適宜的運(yùn)動(dòng)鍛煉能作為心梗后康復(fù)的有效手段，但運(yùn)動(dòng)康復(fù)的作用靶點(diǎn)及其機(jī)制仍需研究完善。

外泌體（exosome）是由細(xì)胞分泌產(chǎn)生的大小為30～150 nm的小膜泡。多種細(xì)胞在正常及病理狀態(tài)下產(chǎn)生核內(nèi)體，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷產(chǎn)生多囊泡體，多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到細(xì)胞外環(huán)境形成外泌體，因此在機(jī)體的血液、汗液、尿液、唾液等體液中存在大量的外泌體（El Andaloussi et al.，2013；Tkach et al.，2016）。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體是細(xì)胞間通訊的重要途徑，作為生物信息的載體，其包含諸多miRNAs、DNA和蛋白質(zhì)等生物信息物質(zhì)?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，外泌體可作為載體遞送蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)通訊，促進(jìn)心臟肥大（Datta et al.，2017）；心包液中的外泌體富含的miRNAs具有促進(jìn)血管新生的作用（Beltra‐mi et al.，2017）；外泌體也可以作為蛋白藥物載體，運(yùn)輸特定靶點(diǎn)蛋白（Cho et al.，2018；Dougherty et al.，2017）。外泌體作為參與體內(nèi)細(xì)胞間運(yùn)輸、信息交換和物質(zhì)循環(huán)的重要載體，鮮見(jiàn)其在運(yùn)動(dòng)促進(jìn)心梗心臟的康復(fù)中發(fā)揮重要作用的研究。

外泌體作為囊泡運(yùn)輸調(diào)節(jié)機(jī)制的重要途徑，在體內(nèi)循環(huán)、免疫、神經(jīng)調(diào)節(jié)等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究表明，不同運(yùn)動(dòng)方式均可激活體內(nèi)能量代謝關(guān)鍵蛋白激酶AMPK，對(duì)此，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，采用AMPK激動(dòng)劑AICAR干預(yù)，模擬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)刺激（Narkar et al.，2008），探討AICAR干預(yù)促進(jìn)H9C2細(xì)胞吞運(yùn)HUVEC細(xì)胞來(lái)源外泌體抑制細(xì)胞凋亡的可能途徑。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

主要儀器：Bio-Rad電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)、Leica倒置熒光顯微鏡、Olympus正置光學(xué)顯微鏡、VINNO6心動(dòng)彩超儀、小動(dòng)物運(yùn)動(dòng)跑臺(tái)等。

主要試劑：AICAR（selleck，S1802）、LPS（Sigma，L4130）、PKH26（上海宇玫博）、外泌體抽提試劑盒（上海宇玫博）、CD9（abcam，ab236630）、CD81（abcam，ab79559）、Bcl-2（CST，#15071）、Bax（abcam，ab32503）、cleaved-Caspase3（abcam，ab2303）等。

1.2 動(dòng)物分組及運(yùn)動(dòng)方案

動(dòng)物分組：在西安交通大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)中心購(gòu)得C57/BL6小鼠24只，隨機(jī)分成3組，每組8只。分組包括假心梗組（S組）、心梗組（MI組）和心梗運(yùn)動(dòng)組（ME組）。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后對(duì)MI組和ME組進(jìn)行左心室冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎（left anterior descending of the coronary artery,LAD）手術(shù)制備心梗模型，S組小鼠僅開(kāi)胸穿線，不結(jié)扎，作為手術(shù)對(duì)照。

運(yùn)動(dòng)方案：術(shù)后休息1周，對(duì)ME組小鼠進(jìn)行6周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)方案為：12 m/min，60 min/天，5天/周×6周（Schefer et al.，1996）。

1.3 小鼠心動(dòng)超聲檢測(cè)及取材

心動(dòng)超聲檢測(cè)：小鼠運(yùn)動(dòng)結(jié)束后異氟醚麻醉，備皮后手術(shù)臺(tái)固定，使用小鼠超聲探頭獲取心臟長(zhǎng)軸M型超聲圖，測(cè)量左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular internal dimension systole，LVIDs）和左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular internal dimension diastolic，LVIDd），軟件計(jì)算左心室短軸縮短率（fractional shortening，F(xiàn)S）和射血分?jǐn)?shù)（ejection fractions，EF）。

心臟取材：6周運(yùn)動(dòng)結(jié)束24 h后，小鼠進(jìn)行異氟醚麻醉并固定，低溫環(huán)境開(kāi)胸迅速摘取心臟于液氮或甲醛保存。液氮凍存的心臟組織用于分子檢測(cè)，甲醛固定的組織用于形態(tài)學(xué)檢測(cè)。

1.4 石蠟切片Masson和TUNEL染色

Masson染色：心臟組織甲醛固定48h后，流水沖洗4 h，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋和切片操作，嚴(yán)格按照Masson染色試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行心臟Masson染色。光學(xué)顯微鏡觀察并拍照，Image Pro Plus軟件統(tǒng)計(jì)膠原容積百分比（collagen volume fraction%，CVF%）。

TUNEL檢測(cè)：嚴(yán)格按照TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。5 μm石蠟切片脫蠟脫水，滴加蛋白酶K置于濕盒中，37℃孵育30 min，PBS清洗5 min×5次，于濕盒中37℃避光孵育TUNEL檢測(cè)液1 h，PBS清洗5 min×5次，封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察陽(yáng)性顆粒。

1.5 HUVEC和H9C2細(xì)胞培養(yǎng)及分組

細(xì)胞培養(yǎng)方法：采用10%FBS DMEM培養(yǎng)基于37℃CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞（H9C2），采用不含外泌體的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human um‐bilical vein endothelial cells，HUVEC）。在干預(yù)細(xì)胞前統(tǒng)一更換為不含牛血清及外泌體的培養(yǎng)基，使用AMPK激動(dòng)劑（acadesine，AICAR）模擬細(xì)胞水平運(yùn)動(dòng)效應(yīng)，脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)細(xì)胞損傷模型。

細(xì)胞干預(yù)分組：使用無(wú)外泌體培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞，提取外泌體；使用外泌體（exo）、AMPK激動(dòng)劑（AICAR，2 mmol/L，24 h）、脂多糖（LPS，10 μg/mL，4 h）干預(yù)H9C2細(xì)胞，將H9C2細(xì)胞分為正常組（H9C2），＋LPS＋exo組，＋AICAR＋LPS＋exo組。

1.6 外泌體提取及鑒定

100 mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞，在HUVEC細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)更換為無(wú)外泌體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)基。按照外泌體提取試劑盒抽提外泌體。提取后的外泌體分別進(jìn)行納米顆粒示蹤分析（Nanoparti‐cle Tracking Analysis，NTA）鑒定和Western Blotting檢測(cè)。

取20 μL外泌體并按體積比例加入5×loading buffer后100℃變性，Western Blotting檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白CD9、CD81、TSG101，連續(xù)上樣3次排除誤差。粒徑結(jié)果和Western Blotting結(jié)果顯示，抽提到的外泌體分布在100～150 nm，且外泌體marker鑒定結(jié)果為陽(yáng)性，表明HUVEC細(xì)胞可分泌產(chǎn)生外泌體（圖1）。

1.7 外泌體內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)

使用PHK26紅色熒光孵育外泌體，將外泌體按照等量體積（96孔板每孔加30 μL外泌體，6孔板每孔加100 μL外泌體）加入H9C2細(xì)胞孵育培養(yǎng)24 h，檢測(cè)H9C2細(xì)胞對(duì)外泌體的吞運(yùn)情況。

1.8 培養(yǎng)細(xì)胞TNUEL檢測(cè)

嚴(yán)格按照TUNEL檢測(cè)試劑盒操作。收集細(xì)胞，PBS洗1次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min后，制備細(xì)胞涂片。0.3%PBS稀釋的Triton X-100室溫孵育樣品5 min，PBS洗3次×5 min/次。在樣品上加50 μL TUNEL檢測(cè)液，37℃避光孵育60 min，PBS洗3次×5 min/次，封片。熒光顯微鏡下觀察TUNEL陽(yáng)性顆粒。

圖1 外泌體NTA及Western Blotting鑒定結(jié)果Figure 1.NTA and Western Blotting Identification of Exosomes

1.9 培養(yǎng)細(xì)胞Hoechst 33342染色

使用標(biāo)準(zhǔn)6孔板培養(yǎng)H9C2細(xì)胞，待條件培養(yǎng)完成后更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，將濃度為100×的Hoechst 33342活細(xì)胞染色液稀釋為1×，1 mL培養(yǎng)基添加10 μL Hoechst 33342染色液，37℃孵育30～60 min后PBS洗3次。熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞核高亮、皺縮則判斷為凋亡細(xì)胞陽(yáng)性。

1.10 蛋白提取和Western Blotting

動(dòng)物蛋白提取：剪取50 mg液氮保存的心臟組織，加入300 μL提前配制的裂解液混合物，冰浴下勻漿，離心取上清進(jìn)行BCA蛋白定量，后按比例加入5×loading buf‐fer，蛋白變性后用于Western Blotting檢測(cè)。

細(xì)胞蛋白提?。菏占?xì)胞蛋白，按比例加入蛋白抽提液，超聲震蕩破裂蛋白，4℃離心，取蛋白上清，進(jìn)行BCA蛋白定量。

Western Blotting實(shí)驗(yàn)：SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，室溫下5%BSA封閉1 h，4℃過(guò)夜孵育一抗。次日TBST清洗，室溫孵育二抗1 h，再次TBST清洗。滴加ECL發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)發(fā)光成像。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

Western Blotting結(jié)果圖片使用Image J進(jìn)行灰度統(tǒng)計(jì)，Hoechst 33342核染色，TUNEL實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)陽(yáng)性顆粒數(shù)目。使用SPSS進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示，選擇95%置信區(qū)間。并使用GraphPad Prism 8進(jìn)行作圖。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 有氧運(yùn)動(dòng)抑制心梗小鼠心肌細(xì)胞凋亡

小鼠心臟石蠟切片TUNEL檢測(cè)（TUNEL陽(yáng)性顆粒為綠色熒光）細(xì)胞凋亡陽(yáng)性顆粒數(shù)目，與S組比較，MI組細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增加（P＜0.05）；與MI組比較，ME組細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著減少（P＜0.05，圖2）。

圖2 小鼠心肌TUNEL染色觀察與統(tǒng)計(jì)結(jié)果Figure 2.TUNEL Staining Results of Myocardium

提取小鼠心肌蛋白，Western Blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和 cleaved-Caspase3，與 S組比較，MI組 Bax/Bcl-2比值和cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與MI組比較，ME組Bax/Bcl-2比值和cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），表明心梗誘發(fā)小鼠心肌細(xì)胞凋亡，有氧運(yùn)動(dòng)顯著抑制心梗后心肌細(xì)胞凋亡（圖3）。

圖3 小鼠心肌Bax、Bcl-2和cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)結(jié)果Figure 3.Expression of Apoptotic Proteins Bax，Bcl-2 and cleaved-Caspase3 in Myocardium

2.2 有氧運(yùn)動(dòng)降低心梗心肌纖維化并改善心功能

小鼠超聲心動(dòng)圖（圖4）結(jié)果顯示，與S組比較，MI組LVIDd和LVIDs顯著增加（P＜0.01），EF和FS顯著降低（P＜0.01）；與MI組比較，ME組LVIDd和LVIDs顯著降低（P＜0.01），EF和FS顯著增加（P＜0.01），表明有氧運(yùn)動(dòng)顯著改善心梗小鼠心功能。

圖4 小鼠心動(dòng)超聲圖及心功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Figure 4.Echocardiography and Cardiac Function Test Results in Mice

心肌Masson染色觀察顯示，心肌膠原纖維呈藍(lán)色，心肌纖維呈紅色。與S組比較，MI組顯著增加（P＜0.05）；與MI組比較，ME組顯著降低（P＜0.05，圖5），表明有氧運(yùn)動(dòng)顯著降低心梗心肌CVF%，減緩心梗心肌纖維化。

圖5 心梗小鼠心臟Masson染色結(jié)果Figure 5.Masson Staining Results in the Heart of Myocardial Infarction Mice

2.3 運(yùn)動(dòng)促進(jìn)H9C2細(xì)胞吞運(yùn)HUVEC細(xì)胞來(lái)源的外泌體

使用AICAR和LPS干預(yù)H9C2細(xì)胞，并使用HUVEC細(xì)胞分泌的外泌體孵育H9C2細(xì)胞，PKH26（紅色熒光）標(biāo)記外泌體，α-Actinin（綠色熒光）標(biāo)記H9C2細(xì)胞。結(jié)果顯示，正常組（H9C2組）無(wú)外泌體，與單純LPS誘導(dǎo)的H9C2凋亡組比較，AICAR干預(yù)24 h顯著促進(jìn)H9C2對(duì)外泌體的吞運(yùn)（圖6），表明運(yùn)動(dòng)干預(yù)促進(jìn)H9C2細(xì)胞對(duì)HUVEC細(xì)胞來(lái)源的外泌體的內(nèi)吞。

圖6 外泌體內(nèi)吞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 6.Results of Immunofluorescence Experiment of Exocytosis

2.4 運(yùn)動(dòng)促進(jìn)心肌細(xì)胞吞運(yùn)外泌體抑制LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡

使用Hoechst33342細(xì)胞核固縮染色和TUNEL標(biāo)記凋亡細(xì)胞，核固縮染色中凋亡細(xì)胞核呈緊密、固縮、高亮的藍(lán)色熒光，TUNEL標(biāo)記中紅色熒光為凋亡陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)果顯示，使用外泌體孵育細(xì)胞后，與單純LPS誘導(dǎo)的H9C2凋亡組比較，AICAR干預(yù)后顯著抑制H9C2細(xì)胞凋亡（P＜0.05，圖7），表明AICAR干預(yù)促進(jìn)H9C2細(xì)胞內(nèi)吞外泌體，顯著抑制心肌細(xì)胞凋亡。

圖7 Hoechst 33342染色及TUNEL檢測(cè)H9C2細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 7.Hoechst 33342 Staining and TUNEL Detection of H9C2 Apoptosis

Western Blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和cleaved-Caspase3，與單純LPS誘導(dǎo)的H9C2凋亡組比較，AIACR干預(yù)后Bax/Bcl-2比值和cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），表明同樣使用外泌體孵育細(xì)胞后，AICAR干預(yù)顯著抑制H9C2細(xì)胞凋亡（圖8）。

圖8 H9C2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)結(jié)果Figure 8.Expression of Apoptotic Proteins Bax，Bcl-2 and cleaved-Caspase3 in H9C2 Cell

3 討論

外泌體由機(jī)體的多種組織細(xì)胞分泌產(chǎn)生，廣泛存在于動(dòng)物血液、汗液和尿液等體液中。作為細(xì)胞間信息傳遞的新途徑，外泌體在心血管、免疫和腫瘤等諸多疾病中均發(fā)揮作用，因此備受關(guān)注（Grigorian-Shamagian et al.，2017；Hervera et al.，2018；Riazifar et al.，2019；Ricklefs et al.，2018）。外泌體作為載體可攜帶的miRNAs，DNA，蛋白質(zhì)等生物信息物質(zhì)，在機(jī)體不同生理、病理環(huán)境下會(huì)產(chǎn)生不同變化（Goetzl et al.，2017）。運(yùn)動(dòng)后機(jī)體汗液、循環(huán)血量、尿液等會(huì)發(fā)生適應(yīng)性變化，如分泌汗液增加、循環(huán)血量增加等，這些體液隨著運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生變化，而外泌體大量存在于其中，因此外泌體很大程度受運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)。有研究將外泌體作為載體，向豬模型心梗心臟特異性注射外泌體，使其作為“補(bǔ)丁”改善心功能，證實(shí)外泌體具有修復(fù)心梗心臟的功能（Gao et al.，2018）。然而，運(yùn)動(dòng)能否通過(guò)調(diào)節(jié)外泌體的內(nèi)吞效率，在心梗心臟的預(yù)防或康復(fù)中發(fā)揮作用，仍有待深入研究。因此，本研究以運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體細(xì)胞外泌體內(nèi)吞效率的影響為研究思路，旨在探討運(yùn)動(dòng)對(duì)外泌體內(nèi)吞的影響及其對(duì)外泌體抑制心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用。

心肌細(xì)胞可通過(guò)血液循環(huán)實(shí)現(xiàn)與血管內(nèi)皮細(xì)胞的交叉對(duì)話（Kivela et al.，2019），血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用受運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放包括激素、蛋白和microRNA等組分，參與心肌細(xì)胞的保護(hù)（De Keulenaer et al.，2017）。然而，鮮見(jiàn)關(guān)于內(nèi)皮細(xì)胞釋放的外泌體能否被心肌細(xì)胞內(nèi)吞的報(bào)道。因此，本研究提取HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生的外泌體干預(yù)H9C2心肌細(xì)胞，觀察內(nèi)皮細(xì)胞釋放的外泌體在心肌細(xì)胞中的內(nèi)吞效果。熒光染色結(jié)果顯示，標(biāo)記外泌體的PKH26（紅色熒光）與心肌細(xì)胞骨架蛋白α-Actinin（綠色熒光）發(fā)生共定位（圖6），證實(shí)心肌細(xì)胞能夠內(nèi)吞內(nèi)皮細(xì)胞釋放的外泌體。目前鮮見(jiàn)研究探討運(yùn)動(dòng)對(duì)外泌體內(nèi)吞效率的影響，為此本研究采用AICAR模擬運(yùn)動(dòng)刺激（Narkar et al.，2008），發(fā)現(xiàn)與LPS＋exo組比較，LPS＋exo＋AICAR組外泌體內(nèi)吞數(shù)量顯著增加（圖6），表明模擬運(yùn)動(dòng)干預(yù)增加心肌細(xì)胞對(duì)外泌體的內(nèi)吞效率。上述結(jié)果提示，運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)促進(jìn)心肌細(xì)胞內(nèi)吞內(nèi)皮細(xì)胞釋放的外泌體，提高心肌細(xì)胞外泌體的內(nèi)吞效率。

細(xì)胞凋亡是在生物體中發(fā)生的程序性細(xì)胞死亡的一種形式，是生化事件導(dǎo)致細(xì)胞特征性變化和死亡，這些變化包括細(xì)胞皺縮、核破裂、染色質(zhì)濃縮和染色體DNA片段化等（Fritsch et al.，2019；Newton et al.，2019）。適度細(xì)胞凋亡對(duì)于生物體的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，但過(guò)度凋亡則促進(jìn)多種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展（Zhang et al.，2018a）。心肌細(xì)胞凋亡受各種應(yīng)激因素誘導(dǎo)，如某些細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激、DNA損傷和鐵依賴型死亡等。因此，抑制心肌細(xì)胞凋亡是心梗心臟康復(fù)的重要靶點(diǎn)之一。外泌體作為體內(nèi)多種生物活性物質(zhì)的載體，通過(guò)運(yùn)輸傳遞各類生物信息的方式，在多種組織器官中參與調(diào)控細(xì)胞凋亡的發(fā)展進(jìn)程。骨組織相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體通過(guò)運(yùn)載miR-21至髓核細(xì)胞，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和細(xì)胞凋亡（Cheng et al.，2018；Zhang et al.，2018b）。在胸腺癌細(xì)胞中外泌體介導(dǎo)的lncRNA轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入癌細(xì)胞后，促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡進(jìn)程（Wang et al.，2018）。心肌細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)促進(jìn)miR-342-5p分泌并通過(guò)外泌體途徑靶向缺血性心臟的心肌細(xì)胞，通過(guò)抑制心肌細(xì)胞凋亡改善缺血心臟心功能，且主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞是運(yùn)動(dòng)后循環(huán)系統(tǒng)外泌體miR-342-5p增加的主要來(lái)源（Hou et al.，2019）。在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)檢測(cè)凋亡相關(guān)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，與外泌體單獨(dú)干預(yù)比較，外泌體和AICAR合并干預(yù)后TUNEL陽(yáng)性顆粒數(shù)目、Bax/Bcl-2比值和cleaved-Caspase3顯著降低（圖7～圖8），表明外泌體和模擬運(yùn)動(dòng)協(xié)同干預(yù)抑制細(xì)胞凋亡的效果顯著優(yōu)于外泌體單獨(dú)干預(yù)。同時(shí)，在體研究表明，運(yùn)動(dòng)抑制心梗心肌細(xì)胞凋亡，改善心功能。提示，運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞外泌體吞運(yùn)方式，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用，也表明運(yùn)動(dòng)在外泌體運(yùn)輸過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用（圖9）。

圖9 運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)促進(jìn)心肌細(xì)胞外泌體內(nèi)吞抑制心肌細(xì)胞凋亡Figure 9.Exercise Inhibits Myocardial Apoptosis by Promoting Exocytosis of Myocardial Cells

運(yùn)動(dòng)效應(yīng)可能通過(guò)改變細(xì)胞對(duì)外泌體的內(nèi)吞效率進(jìn)而對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響，直接提取運(yùn)動(dòng)干預(yù)后的外泌體進(jìn)行動(dòng)物注射干預(yù)和體外細(xì)胞培養(yǎng)，檢測(cè)外泌體內(nèi)吞變化，對(duì)細(xì)胞外泌體內(nèi)吞過(guò)程進(jìn)行高分辨率實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)追蹤檢測(cè)，能更加全面反映運(yùn)動(dòng)對(duì)外泌體運(yùn)輸過(guò)程的影響，這有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

有氧運(yùn)動(dòng)顯著抑制心梗心肌細(xì)胞凋亡，改善心功能；HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞可分泌產(chǎn)生外泌體，且AMPK激動(dòng)劑AICAR顯著促進(jìn)H9C2心肌細(xì)胞對(duì)HUVEC細(xì)胞來(lái)源的外泌體內(nèi)吞，抑制H9C2心肌細(xì)胞凋亡。推測(cè)，運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)促進(jìn)心肌細(xì)胞外泌體內(nèi)吞，抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善心梗心功能。