張雨笑 ，諶志筠 ，孫琳 ，2，何秋水 ，3

1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，北京100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院呼吸疾病研究室，北京100045；3.芬蘭圖爾庫大學(xué)醫(yī)學(xué)微生物和免疫學(xué)系，圖爾庫20520

百日咳桿菌（Bordetella pertussis）系鮑特氏菌屬成員，其感染所致的百日咳是嬰幼兒多見的急性呼吸道傳染病。自20 世紀(jì)50 年代許多國家開始大規(guī)模接種疫苗以來，百日咳的發(fā)病率和死亡率顯著降低。WHO 于2008 年在全球范圍內(nèi)報告約1 600 萬病例，95%的病例發(fā)生在發(fā)展中國家，其中195 000 例兒童死亡，可見百日咳是重要的全球公共衛(wèi)生問題之一［1］。

盡管疫苗覆蓋率較高，近年來我國和許多其他國家均出現(xiàn)百日咳發(fā)病率上升的情況，在個別地區(qū)甚至有不同程度的暴發(fā)流行［2-6］。本課題組前期血清流行病學(xué)調(diào)查表明，2016 年北京市20 ～39 歲育齡人群中百日咳發(fā)病率為4%，而抗體未檢出率高達(dá)57.4%，表明育齡人群易感染百日咳桿菌［3］。家庭成員是嬰幼兒患百日咳的最主要傳染源［7-8］，育齡期人群百日咳發(fā)病率的升高，增加了嬰幼兒患病的風(fēng)險。

百日咳桿菌可產(chǎn)生多種毒力因子，其中百日咳毒素（pertussis toxin，PT）是其特異毒力因子，是無細(xì)胞百日咳（acellular pertussis vaccine，APV）主要抗原成分之一，感染和接種疫苗后可產(chǎn)生針對PT 的特異性抗體。因此，ELISA 法檢測抗PT 特異性IgG 抗體（PT-IgG）可用于診斷百日咳桿菌的感染，也可評估感染或疫苗接種后的免疫持久性。由于PT 具有毒性，用于APV 生產(chǎn)時必須經(jīng)化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行脫毒處理。研究表明，甲醛脫毒的PT 不能被具有保護(hù)功能的單抗隆抗體1B7 和11E6 識別并結(jié)合，表明甲醛脫毒可使PT 重要的抗原表位丟失［9］。與自然感染比較，疫苗接種后產(chǎn)生抗PT 特異性抗體的中和能力會降低，因此，只檢測PT-IgG 抗體濃度并不能完全說明抗體的功能。本研究利用PT 可使CHO 細(xì)胞簇集的特性建立抗PT 中和抗體的檢測方法，并應(yīng)用于檢測健康成人血清中抗PT 中和抗體的含量。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 CHO 細(xì)胞購自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。

1.2 PT 及血清 未脫毒的PT 純化蛋白（105.5 μg／mL）由葛蘭素史克公司惠贈；血清來源于在北京市朝陽區(qū)疾病預(yù)防控制中心體檢的20 ～39 歲健康人群，從598 份經(jīng)血清流行病學(xué)檢測的血清樣本中隨機(jī)選取 109 份［3］。

1.3 主要試劑及儀器 PT-IgG 抗體ELISA 檢測試劑盒購自德國維潤賽潤公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.05% EDTA-胰酶和 96 孔板均購自美國Corning 公司。

1.4 PT 最適終濃度的確定 將濃度為105.5 μg／mL的未脫毒PT 蛋白用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行10 倍系列稀釋至105.5 ng ／ mL，再將其進(jìn)行倍比稀釋至0.1 ng ／ mL。將不同濃度未脫毒PT 蛋白（0.1 ～ 105.5 ng ／ mL）加入至 96 孔板中，每個濃度各設(shè) 8 個復(fù)孔，100 μL ／孔；加入濃度為 105個 ／mL的 CHO 細(xì)胞懸浮液，100 μL ／孔，并設(shè)細(xì)胞對照，于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，置倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞簇集現(xiàn)象。結(jié)果以1 個視野下全部細(xì)胞出現(xiàn)簇集為陽性，定義為1 個致細(xì)胞病變單位（CPU），相反則為陰性。為可檢測到低效價的中和抗體，PT 的最適終濃度規(guī)定為 4 CPU［10］。

1.5 方法的建立 將25 μL 待檢血清加入至96 孔板第1 列，用含10% FBS 和1%青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行倍比稀釋（1 ∶4 ～ 1 ∶4 096），50 μL ／孔，每份血清設(shè) 2 個復(fù)孔；每孔加入 50 μL 濃度為最適終濃度的未脫毒PT 蛋白，37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中和 3 h；加入 105個 ／ mL 的CHO 細(xì)胞懸液，100 μL ／ 孔，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，觀察結(jié)果，并設(shè)細(xì)胞對照、PT 對照及血清對照。血清的中和抗體效價為不引起細(xì)胞簇集現(xiàn)象的最高稀釋倍數(shù)［10］。每次試驗使用同一份標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.6 方法的重復(fù)性驗證 隨機(jī)選取8 份血清樣品（編號分別為 10、52、93、622、629、672、962、978），每份樣品用建立的方法重復(fù)檢測4 次，計算變異系數(shù)（CV）。

1.7 方法的應(yīng)用 采用PT-IgG 抗體ELISA 試劑盒及本實驗建立的方法分別檢測109 份血清樣品的PT-IgG 抗體水平及PT 中和抗體水平，并分析兩者的分布情況及相關(guān)性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 24 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，血清PT-IgG 抗體濃度與中和抗體效價間的比較采用皮爾森相關(guān)系數(shù)法，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PT 的最適終濃度 PT 濃度為 0.21 ng ／ mL時，96 孔板中細(xì)胞全部產(chǎn)生簇集，此時PT 濃度記為1 個CPU，見圖1。因此，確定PT 中和試驗中，當(dāng)每孔液體量為200 μL 時，PT 的最適終濃度為0.84 ng ／ mL。

圖1 顯微鏡下觀察CHO 細(xì)胞的簇集情況（× 100）Fig.1 Cluster of CHO cells under microscope（× 100）

2.2 方法的重復(fù)性 8 份血清重復(fù)4 次檢測中和抗體含量結(jié)果CV 為0.00% ～12.28%，見表1。表明該方法重復(fù)性良好。

表1 重復(fù)性驗證結(jié)果Tab.1 Verification for reproducibility

2.3 方法的應(yīng)用

2.3.1 PT 中和抗體及PT-IgG 抗體的分布 109 份血清樣品中，20 份血清樣品的中和抗體效價為128 ～ 256，44 份為 32 ～ 64，25 份為 8 ～ 16，20 份 ＜ 8。中和抗體效價分布范圍是 ＜4 ～256，中位數(shù)為32，幾何平均效價（GMT）為 27.12（95% CI：20.78 ～35.39）。109 份血清樣品中，PT-IgG 抗體的濃度 ≥100 IU ／ mL 的有 3 份，表示 1 年內(nèi)感染過百日咳桿菌；40 ～ 100 IU ／ mL 的有 20 份，表示 2 ～ 3 年內(nèi)感染過百日咳桿菌；＜ 40 IU ／mL 的有 86 份，表示 2 ～3 年內(nèi)未感染過百日咳桿菌。PT-IgG 抗體分布范圍為 0.03 ～ 184.80 IU ／mL，中位數(shù)為 21.17 IU ／mL，GMT為 13.33 IU ／mL（95%CI：9.95 ～ 17.87 IU ／mL）。

2.3.2 PT 中和抗體效價與IgG 抗體濃度的相關(guān)性109 份血清樣品的PT-IgG 抗體濃度與中和抗體效價間呈明顯相關(guān)性（r = 0.77，P ＜0.01）。但存在兩者不一致的現(xiàn)象，23 份PT-IgG 抗體濃度 ≥ 4 0 IU ／ mL 的血清中，有2 份樣品的中和抗體效價僅為32，6 份中和抗體效價為256，表明有2 例曾患過百日咳的體檢人員血清樣品抗體中和PT 毒性的能力有限。109 份血清樣本的中和抗體效價為64 的31 份血清樣品中，PT-IgG 抗體濃度范圍為 10.8 ～ 77.8 IU ／ mL，見圖 2。表明即使抗體濃度低，但其中和PT 毒性的能力較高。

圖 2 20 ～39 歲健康人群血清中PT-IgG 抗體濃度與中和抗體效價的相關(guān)性Fig.2 Relationship between PT-IgG concentration and neutralizing antibody titer in sera of healthy individuals at ages of 20 ～39 years

3 討 論

PT 是百日咳桿菌產(chǎn)生的特異毒力因子，尚未發(fā)現(xiàn)與其他病原微生物存在交叉反應(yīng)。PT 為最復(fù)雜的可溶性細(xì)菌蛋白之一，具有典型的A-B 型結(jié)構(gòu)（AB5），A 原體由具有酶活性的S1 亞基組成，其催化三聚體G 蛋白的α 亞基的ADP-核糖基化，從而干擾靶細(xì)胞的代謝功能。B 寡聚體由 1S2：1S3：2S4：1S5組成，負(fù)責(zé)與靶細(xì)胞受體的結(jié)合，并通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和逆向運輸進(jìn)行胞內(nèi)運輸［11-13］。HEWLETT等［14］使用 CHO 細(xì)胞檢測 PT 毒性，觀察到 PT 的毒性可使細(xì)胞變?yōu)閳A形并形成簇，這種形態(tài)的改變是由于PT 催化了細(xì)胞底物的ADP-核糖基化［15］。目前，CHO 細(xì)胞簇集實驗多用來檢測無細(xì)胞百日咳疫苗中脫毒PT 的殘余毒性［16-18］。人血清中特異性的PT 抗體可中和PT 的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，進(jìn)而抑制其引起的CHO 細(xì)胞簇集現(xiàn)象。本研究通過CHO 細(xì)胞簇集實驗獲得PT 最佳終濃度為 0.84 ng ／ mL，建立了PT 中和試驗用于檢測血清PT 中和抗體含量。重復(fù)性驗證CV 為0.00% ～12.28%，表明建立的方法重復(fù)性良好。

血清中和抗體檢測結(jié)果顯示，育齡人群中PTIgG 抗體濃度與中和抗體效價之間呈明顯相關(guān)性。但人群中存在PT-IgG 抗體濃度高，中和抗體效價低的現(xiàn)象，如23 份在2 ～3 年內(nèi)感染過百日咳（PTIgG ≥ 40 IU ／ mL）的血清，其中和抗體效價的范圍為32 ～256，最高的中和抗體效價為最低的8 倍。同時也存在中和抗體效價高，但PT-IgG 抗體濃度低的現(xiàn)象，如中和抗體效價為64 時，PT-IgG 抗體濃度范圍為10.8 ～ 77.8 IU ／ mL，最高濃度為最低的 7.2 倍，表明PT-IgG 抗體的濃度并不能完全反映抗體的功能。目前常通過檢測疫苗接種后抗體水平來評價疫苗效果，而無細(xì)胞疫苗生產(chǎn)過程中的化學(xué)脫毒會使PT 重要的抗原表位丟失，因此評價百日咳疫苗的效果尤其是無細(xì)胞疫苗的效果需同時檢測抗體的水平和功能。

ELISA 法具有操作快捷的特點，廣泛應(yīng)用于百日咳的流行病學(xué)監(jiān)測及評估機(jī)體接種疫苗或感染百日咳桿菌后的免疫反應(yīng)［19］。本研究建立的CHO細(xì)胞簇集試驗雖耗時較長，但重復(fù)性較好，可用于檢測血清百日咳抗體的功能，進(jìn)而更有效評估百白破組分疫苗的臨床免疫效果，并評價疫苗效力與中和抗體水平的相關(guān)性。本實驗采用的是未脫毒PT 蛋白，今后在該方法的應(yīng)用中，需要考慮使用PT 國家參考品進(jìn)行進(jìn)一步驗證。