樊雪，王一平，李璇，修雪亮，廖輝，周荔葆

遼寧成大生物股份有限公司研發(fā)部，遼寧沈陽110179

甲型肝炎（hepatitis A，HA）滅活疫苗（MRC-5 細胞）系將甲型肝炎病毒接種至人二倍體細胞中，經培養(yǎng)、收獲、病毒純化及滅活后，加入鋁佐劑制成，用于預防甲型肝炎［1］。在HA 滅活疫苗生產工藝中，需加入乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）對細胞進行消化，后續(xù)工藝中可能有部分殘留。EDTA-2Na 易與鈣螯合，長期大劑量服用或靜脈輸注速度過快可引起低鈣血癥。研究表明，腎損傷、結核病及心臟功能損傷患者應慎用［2］。EDTA-2Na 與 FeCl3在酸性條件下發(fā)生絡合反應，生成具有紫外吸收的穩(wěn)定的絡合物，因此可采用HPLC 法進行測定。目前，國內外HPLC 法檢測EDTA-2Na 殘留量主要應用于化學藥品和食品領域［3-6］，疫苗中EDTA-2Na 殘留量檢測的參考文獻較少。

本文建立了檢測HA 滅活疫苗（MRC-5 細胞）中EDTA-2Na 殘留量的HPLC 法，并對方法進行驗證。

1 材料與方法

1.1 供試品及對照品 3 批HA 滅活疫苗原液供試品（批號：HAV20170202-原、HAV20170301-原及HAV20170302-原）由遼寧成大生物股份有限公司生產；EDTA-2Na 對照品（批號：K1424041）購自美國阿拉丁公司。

1.2 主要試劑及儀器 乙腈（批號：137696）及磷酸（批號：158625）購自美國Fisher 公司；磷酸二氫銨（批號：C10079253）購自上海 Macklin 公司；40%四丁基氫氧化銨（批號：A1703020）購自美國阿拉丁公司；FeCl3（批號：STBG6072）購自美國Sigma 公司；LC-2010A 型高效液相色譜儀購自日本SHIMADZU 公司；C18 色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）分別購自美國Thermo 公司和Waters 公司；所有試劑均為色譜純。

1.3 色譜條件及優(yōu)化 采用反相色譜柱。流動相為水相-有機相，水相為四丁基氫氧化銨的磷酸鹽溶液（離子對試劑）［7-8］，用磷酸調 pH，經 0.22 μm 濾膜過濾，超聲，有機相為乙腈；流速為1.0 mL ／ min；檢測波長為 257 nm［9-11］；進樣量為 20 μL；柱溫為30 ℃；保留時間為10 min。供試品中EDTA-2Na 色譜峰的保留時間在7 ～9 min之間，分離度大于1.5的色譜條件為最適條件。

1.3.1 色譜柱的選擇 因EDTA-2Na 與FeCl3反應生成的絡合物與反相色譜柱上的非極性鍵合相之間有保留［7-8］，分別考察美國 Waters 及 Thermo 公司的C18 色譜柱。

1.3.2 流動相的優(yōu)化

1.3.2.1 水相與有機相的比例 因絡合物的極性較大，考察不同比例的水相與有機相（8 ∶2、9 ∶1、9.5 ∶0.5）對色譜條件的影響。

1.3.2.2 pH 絡合物在酸性條件下穩(wěn)定，考察流動相不同pH（2.0、2.4 及3.0）對色譜條件的影響。

1.3.2.3 磷酸鹽確定 分別取濃度為0.005、0.01及0.02 mol ／ L 的磷酸二氫鈉及磷酸二氫銨，加水溶解至1 000 mL，再加入0.4 mol ／ L 四丁基氫氧化銨60 mL，考察不同磷酸鹽對色譜條件的影響。

1.4 溶液的配制

1.4.1 FeCl3溶液 稱取0.06 g FeCl3，溶于預先用磷酸調pH 至2.4 的500 mL 超純水中，配制為0.012%FeCl3溶液。

1.4.2 對照品儲備液 精密稱取EDTA-2Na 對照品100 mg，置100 mL 容量瓶中，用超純水溶解搖勻并定容，配制為 1 000 μg ／ mL EDTA-2Na 對照品儲備液。

1.4.3 對照品工作液 精密量取對照品儲備液1、0.5、0.25 及 0.1 mL，分別至 50 mL 容量瓶中定容，配制濃度為 20、10、5、2 μg ／mL 對照品工作液。精密量取 10 μg ／ mL 對照品工作液 5、2.5、1、0.25 mL，分別至50 mL 容量瓶中定容，配制濃度為1、0.5、0.2、0.05 μg ／ mL 對照品工作液。

1.4.4 供試品溶液 取HAV20170302-原批供試品1 mL，加入 1 mL 0.012% FeCl3溶液，渦流混合 30 s，0.45 μm 濾膜過濾后備用。

1.4.5 空白溶液 取1 mL 超純水，加入1 mL 0.012%FeCl3溶液，0.45 μm 濾膜過濾后備用。

1.5 方法的驗證

1.5.1 系統(tǒng)適用性及專屬性 取5 μg／mL 對照品工作液1 mL，加入1 mL 0.012% FeCl3溶液，渦流混合30 s，0.45 μm 濾膜過濾。按確定的色譜條件進樣6 次，記錄色譜圖，測定理論塔板數及分離度。

1.5.2 線性范圍 分別取 0.2、0.5、1、2、5、10、20 μg／mL對照品工作液1 mL，加入0.012% FeCl3溶液1 mL，渦流混合30 s，0.45 μm 濾膜過濾，按確定的色譜條件進行檢測。以對照品工作液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，繪制標準工作曲線。

1.5.3 準確度 精密量取3 份HAV20170302-原批供試品各 1mL，分別加入 2、5、10 μg ／ mL 對照品工作液1 mL，再加入等體積的 0.012% FeCl3溶液，渦流混合30 s，0.45 μm 濾膜過濾后，按確定的色譜條件進行檢測，計算加標平均回收率及RSD。接受標準：RSD ＜ 5% 。

1.5.4 精密度 精密量取6 份HAV20170302-原批供試品各 1 mL，加入 5 μg ／ mL 對照品工作液，再加入 1 mL 0.012%FeCl3溶液，渦流混合 30 s，0.45 μm濾膜過濾，按確定的色譜條件進行檢測，驗證重復性；次日由2 名試驗員再次測定，驗證中間精密度。計算平均EDTA-2Na 峰面積及RSD。接受標準：RSD ＜5%。

1.5.5 定量限及檢測限 逐步稀釋 5 μg ／ mL 對照品工作液，按確定的色譜條件進行檢測。以信噪比（S ／ N）≥ 10 確定定量限，S ／ N ≥ 3 確定檢測限。

1.5.6 耐用性 分別配制 pH 為 2.0、2.4 及 3.0 的流動相，取 5 μg ／ mL EDTA-2Na 對照品工作液，在每種流動相條件下進樣6 次，計算色譜峰面積的RSD及相對誤差（RE）。接受標準：RSD ＜ 5%，RE 在95% ～105%之間。

1.6 方法的應用 取3 批供試品，按1.4.4 項制備供試品溶液，按確定的色譜條件進樣檢測，記錄峰面積，計算EDTA-2Na 殘留量。

2 結 果

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 色譜柱 兩廠家色譜柱上供試品中EDTA-2Na 的保留時間均為7 ～8 min、分離度均大于1.5、色譜峰對稱性和柱效（理論塔板數大于10 000）均相似，均能達定量檢測的要求，圖略。綜合考慮選用Thermo 公司的C18 色譜柱。

2.1.2 流動相

2.1.2.1 水相與有機相的比例 隨著有機相比例的減少，EDTA-2Na 保留時間逐漸增加，水相與有機相比例為 8 ∶2、9 ∶1、9.5 ∶0.5 時，保留時間分別為5 ～ 6 、7 ～ 8 和 10 ～ 11 min，色譜峰分離度均大于1.5，圖略。選擇9 ∶1 為水相與有機相比例。

2.1.2.2 pH 流動相在 pH 為 2.0、2.4 及 3.0 條件下，供試品中EDTA-2Na 保留時間分別為5 ～6、7 ～ 8 和 10 ～ 11 min，分離度均大于 1.5，圖略。選擇2.4 為最適pH 值。

2.1.2.3 磷酸鹽 磷酸二氫鈉及磷酸二氫銨配制的流動相中，EDTA-2Na 的保留行為相近，二者濃度0.005、0.01 及 0.02 mol ／ L 時，保留時間均分別為4 ～ 5、7 ～ 8 和 11 ～ 12 min，分離度分別小于 1.5、大于1.5 和大于1.5，圖略。綜合考慮選擇0.01 mol／L磷酸二氫銨為最適磷酸鹽。

2.2 方法的驗證

2.2.1 系統(tǒng)適用性及專屬性 EDTA-2Na 對照品色譜峰的理論塔板數不低于10 000，分離度大于1.5，表明方法適用性良好。對照品溶液僅有EDTA-2Na色譜峰，無其他色譜峰干擾，空白溶液及供試品溶液未見該色譜峰，見圖1，表明方法專屬性良好。

2.2.2 線性范圍 EDTA-2Na 對照品在 0.2 ～20 μg ／ mL 范圍內，回歸方程為 Y = 20 482.18 X +0.512 6，R2= 0.999 9，線性關系良好。標準曲線見圖2。

2.2.3 準確度 3 個濃度加標樣品的平均回收率分別為97.44%、100.6%及100.4%，RSD 為1.6%，見表1。表明方法準確度良好。

2.2.4 精密度 試驗員A 重復檢測6 次測得EDTA-2Na 峰面積的RSD 為1.4%；試驗員A 及B 測得中間精密度的RSD 為1.6%。見表2。表明方法的精密度良好。

圖1 空白溶劑（A）、對照品溶液（B）及供試品溶液（C）的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC profiles of blank solvent（A），reference（B）and test sample solution（C）

圖2 EDTA-2Na 對照品的標準曲線Fig.2 Standard curve for reference for DETA-2Na

表1 加標樣品的回收率（%）Tab.1 Recovery rates of spike samples（%）

表2 加標樣品的精密度驗證結果Tab.2 Precision test on spike samples

2.2.5 定量限及檢測限 S ／ N 為 10 時，EDTA-2Na濃度為 0.2 μg ／ mL，即為方法的的定量限，S ／ N 為3 時，EDTA-2Na 濃度為 0.05 μg ／ mL，即為方法的的檢測限。

2.2.6 耐用性 3 種pH 流動相檢測6 次的色譜峰面積RSD 分別為0.24%、0.31%及0.18%；RE 分別為99.25%、99.12%及99.33%。見表3。

2.3 方法的應用 3 批供試品中均未檢出EDTA-2Na。

表3 流動相的耐用性驗證結果Tab 3.Validation for durability of mobile phase

3 討 論

本研究建立了檢測HA 滅活疫苗（MRC-5 細胞）中EDTA-2Na 殘留量的 HPLC 法，根據 EDTA-2Na 與FeCl3在酸性條件反應生成絡合物的性質，采用反向色譜法，用四丁基氫氧化銨作為離子對試劑，調節(jié)流動相pH 值至酸性，考察磷酸二氫鈉及磷酸二氫銨兩種磷酸鹽、不同濃度緩沖溶液（0.005、0.01 及0.02 mol ／ L）、水相與有機相不同比例、流動相的不同pH 值等條件，最終選擇由0.01 mol ／ L 磷酸二氫銨緩沖液配制的四丁基氫氧化銨溶液作為水相，與乙腈比例9 ∶1 組成的流動相為最適條件［12］。本實驗對流動相的不同pH（2.0、2.4 和3.0）進行分析，結果顯示隨pH 升高，待測物的保留時間逐漸增加，但各pH 條件下均能將待測物與雜質有效分離，且專屬性良好，不干擾測定。但pH 為2.0 時已接近色譜柱的pH 耐受下限，長時間會影響色譜柱壽命，pH為3.0 時保留時間較長，影響分析效率。綜合考慮選擇2.4 為最適pH 值。

樣品的前處理過程中需將配制好的酸性FeCl3溶液與供試品進行充分反應，生成穩(wěn)定的絡合物。本文將供試品進行充分旋渦混合，待反應完全后，再采用微孔濾膜過濾除去絡合物沉淀及其他不溶性雜質，避免進樣過程中堵塞色譜柱及色譜儀系統(tǒng)。

本研究成功建立了HA 滅活疫苗中EDTA-2Na 殘留量的HPLC 檢測方法，該方法具有良好的專屬性、線性、準確度、精密度和耐用性，可用于測定本公司生產的HA 滅活疫苗（MRC-5 細胞）中EDTA-2Na 的殘留量。