南建軍，秦海艷，宋憲銘，安晨，宋蘭蘭，趙曉瑞，陳繼軍

蘭州生物制品研究所第四研究室甘肅省疫苗工程技術(shù)中心，甘肅蘭州730046

Protein A 親和層析填料一般是在瓊脂糖或其他微球基架上連接Protein A 配基構(gòu)成的聚合物微球，能特異性地與人免疫球蛋白的Fc 結(jié)構(gòu)域結(jié)合［1］。Protein A 親和層析填料以其高效的特異性捕獲作用廣泛用于單克隆抗體生產(chǎn)純化工藝中，經(jīng)一步捕獲，多數(shù)單克隆抗體純化可達90%以上［2］。不同廠家生產(chǎn)的Protein A 填料有各自不同的基架及鍵合技術(shù)［3］，造成其填料對抗體的捕獲載量及純化效果的差異。

CD52 抗原分子廣泛分布于B 淋巴細胞、T 淋巴細胞、NK 細胞、單核細胞、巨噬細胞表面，尤其在淋巴細胞上表達水平較高?？笴D52 單克隆抗體是一種靶向人CD52 抗原的基因工程抗體，可用于治療慢性淋巴細胞白血病、T 細胞淋巴瘤等疾?。?］。

蘭州生物制品研究所在抗CD52 單克隆抗體生產(chǎn)純化方法中選擇常用的Protein A 填料親和層析。該方法捕獲效率高，獲得的抗體純度理想，但所用填料需進口，貨源單一，僅有美國GE 公司的Mab-Select SuRe 可選，且價格比較昂貴。

目前，隨著技術(shù)的發(fā)展，中國市場出現(xiàn)了國產(chǎn)化的Protein A 親和層析填料，常見的有Protein A Diamond 及 UniMab 50，其中 Protein A Diamond 與 Mabselect SuRe 填料均以交聯(lián)瓊脂糖作為基架，屬軟膠，UniMab 50 填料的基架為一種剛性物質(zhì)，屬硬膠。本文比較這3 種層析填料在抗CD52 單克隆抗體親和純化上載量及純化效果，以期為生產(chǎn)工藝中填料的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品 3 批抗CD52 單克隆抗體培養(yǎng)上清樣品（表1）及已純化的抗CD52 單克隆抗體（濃度為1.24 mg ／ mL）均由蘭州生物制品研究所第四研究室制備。

表1 3 批樣品信息Tab.1 Data on three batches of samples

1.2 主要試劑及儀器 填料MabSelect SuRe（預裝層析柱柱體積為4.7 mL）、AKTA avant 150 層析系統(tǒng)及微量分光光度計NanoVue 均購自美國GE 公司；Protein A Diamond 及 UniMab 50 分別購自 B 和N 公司，預裝層析柱柱體積分別為4.2 及5.0 mL；殘留宿主蛋白檢測試劑盒、外源 DNA 檢測試劑盒及Protein A 檢測試劑盒均購自美國 Cygnus 公司；定量 PCR 預混試劑及ABI 7500 Fast 定量 PCR儀購自美國Thermo 公司；高效液相色譜儀購自沃特世科技（上海）有限公司；深層過濾器3M Zetaplus購自美國3 M 公司；MiliporePellicon 2 Mini Cassette 50 KD 膜包購自美國密理博公司；抗體純度檢測色譜柱（TSKgel Protein A-5PW）購自日本東曹株式會社。

1.3 樣品處理 3 批樣品用深層過濾器3M Zetaplus澄清過濾，過濾后用MiliporePellicon 2 Mini Cassette 50 KD 膜包超濾濃縮，抗體濃度控制在0.8 ～1.5 g／L范圍。

1.4 填料載量的檢測 填料載量以流穿液中抗體濃度達上樣濃度10%時的上樣量確定。3 種填料的標示載量均＞30 mg ／ mL。每種填料載量檢測時均上樣抗CD52 單克隆抗體200 mg，確保其可流穿。分2 步上樣，第 1 步上樣 140 mL，不收集；第 2 步上樣60 mL，收集流穿液，檢測抗體濃度。計算每毫升填料達10%流穿時層析柱捕獲的抗體量，即為最大動態(tài)載量，該最大動態(tài)載量的80%即為填料載量。

1.5 填料純化效果的檢測 使用3 種填料分別純化3 批樣品，每種填料按其測得的載量上樣。按1.4 項每種填料的載量和每批樣品的濃度確定3 批樣品上樣量（表2）。除樣品上樣量外，3 種填料純化工藝參數(shù)保持一致，樣品保留時間為4 min，洗脫pH 為3.70，檢測波長為280 nm，當吸光度升至50 mAu 時開始收集，降至50 mAu 時停止。分別對洗脫收集液中各項指標進行檢測。

浙江省水利工程管理改革、基層水利服務體系建設(shè)等2項全國水利改革試點已取得實質(zhì)性進展。大中型水利工程項目法人制、中小型水利工程相對集中式項目法人及小微型水利工程農(nóng)民自治管理模式等改革已取得初步成效。全省成立了1 023家基層水利服務機構(gòu)、377個農(nóng)村水利合作組織，在編在崗基層水利員2 560人，村級水務員12 724人。同時，連續(xù)幾年多輪深化水行政審批改革，省級審批項目從20項減少到13項，非行政許可事項清理到2項，加快審批服務中介機構(gòu)改革，省級審批承諾辦理時間從20個工作日壓縮到12個工作日。

表2 3 批樣品的上樣量（mL）Tab.2 Loading of three batches of samples（mL）

1.5.1 洗脫體積 在AKTA avant 150 層析系統(tǒng)中，運行Evaluation 對應層析圖譜，進行洗脫體積的積分。

1.5.2 抗體濃度 純化后樣品使用NanoVue 微量分光光度計檢測抗體濃度，并按下式計算抗體回收率。

抗體回收率（%）= 洗脫收集液中抗體總量 ／ 上樣的抗體總量× 100%

1.5.3 抗體純度 采用分子排阻高效液相色譜（SECHPLC）法。抗體純度主要指樣品中單體含量?？贵w純度檢測色譜柱用PBS 平衡后上樣，使用PBS 緩沖液對樣品進行分離，通過高效液相色譜儀系統(tǒng)中分析軟件對波長280 nm 吸收色譜圖進行積分，分析單體含量。計算3 批填料分別對同批樣品純化后單體含量的RSD。

1.5.4 電荷異質(zhì)性 采用陽離子交換高效液相色譜（CEX-HPLC）法［4］。用高效液相色譜儀系統(tǒng)中分析軟件對波長280 nm 吸收色譜圖進行積分，分析洗脫收集液中中性、酸性及堿性電荷變異體的含量。

1.5.5 宿主蛋白殘余量 采用 ELISA 法［5］。按殘留宿主蛋白檢測試劑盒說明書進行檢測。

1.5.6 宿主 DNA 殘余量 采用實時定量 PCR 法［6-7］。按外源DNA 檢測試劑盒說明書進行檢測。

2 結(jié) 果

2.1 填料的載量 填料MabSelect SuRe 載量最高，達38.4 mg ／mL；UniMab 50 載量最低，為 30.1 mg ／mL；ProteinADiamond載量介于以上兩者之間，為33.8mg／mL。見表3。

表3 3 種填料的載量Tab.3 Loading capacities of three media

2.2 填料對樣品的純化效果

2.2.1 洗脫體積及抗體濃度 結(jié)果顯示，3 批樣品中，填料MabselectSuRe 的洗脫收集液體積最大，抗體濃度居中；填料Protein A Diamond 的洗脫收集液體積居中，抗體濃度最低；填料UniMab 50 的洗脫收集液體積最小，抗體濃度最高。見圖1 和圖2。

2.2.2 抗體回收率 結(jié)果顯示，3 批樣品經(jīng)3 種填料純化后的抗體回收率均大于85%，第3 批樣品經(jīng)填料Protein A Diamond 純化后的抗體回收率略低于 UniMab 50 及 MabSelect SuRe，見圖 3。

圖1 3 種填料的洗脫收集液體積Fig.1 Volumes of eluate of three media

圖2 3 種填料洗脫收集液中抗體濃度Fig.2 Antibody concentrations in eluate of three media

圖3 3 種填料的洗脫收集液中抗體回收率Fig.3 Antibody recoveries in eluate of three media

2.2.3 抗體純度 結(jié)果顯示，3 種填料對同批樣品純化后單體含量均 ＞97%，RSD 均≤0.13%，見表4。

表4 3 種填料的洗脫收集液中單體含量（%）Tab.4 Monomer contents in eluate of three media（%）

2.2.4 電荷異質(zhì)性 所有樣品中，3 種填料的洗脫收集液中酸性及中性變異體含量接近，RSD 均＜5%；堿性變異體含量均＜5%。見表5。

2.2.5 宿主蛋白殘余量 與純化前樣品比較，3 種填料對純化后樣品的宿主蛋白去除率均達2 log 以上，其中填料 Protein A Diamond 與 MabSelect SuRe 的殘余宿主蛋白含量相當，均低于UniMab 50，見圖4。

2.2.6 宿主DNA 殘余量 與純化前樣品比較，3 種填料對純化后樣品的宿主DNA 去除率達3 log 以上，在同批樣品中，3 種填料去除宿主DNA 效果相當；第3 批樣品純化后殘余DNA 含量比其他2 批樣品高，但仍在可接受范圍內(nèi)。見圖5。

2.2.7 填料配基Protein A 脫落量 結(jié)果顯示，3 批樣品中，填料UniMab 50 的純化樣品中配基Protein A的脫落量均較Protein A Diamond 及MabSelect SuRe填料高，見圖6。

圖4 3 種填料的洗脫收集液中宿主蛋白殘余量Fig.4 Residual host protein contents in eluate of three media

圖5 3 種填料的洗脫收集液中宿主DNA 殘余量Fig.5 Residual host DNA contents in eluate of three media

表5 3 種填料的洗脫收集液中電荷變異體含量（%）Tab.5 Charge variant contents in eluate of three media（%）

圖6 洗脫收集液中3 種填料的配基Protein A 脫落量Fig.6 Protein A abscission in eluate of three media

3 討 論

本研究選取的3 種填料均以Protein A 為配基來捕獲抗體。填料Protein A Diamond 和MabSelect SuRe以交聯(lián)瓊脂糖作為基架，這種結(jié)構(gòu)上的相似很可能是二者純化效果接近的重要原因。填料UniMab 50以剛性介質(zhì)為基架，意味著其擁有更好的耐壓性能，從而能實現(xiàn)更高的柱床高度且能耐受更大的流速，液體在填料中的流動阻力較小，該填料表現(xiàn)出更小的洗脫體積及更高的洗脫收集液濃度，很可能與此有關(guān)。

3 批樣品中，用3 種填料純化第2 批樣品時，洗脫收集液中聚體含量更高一些，純化第3 批樣品時，洗脫收集液中宿主DNA 殘余量更高一些，這可能與樣品本身如pH 值、電導率、物質(zhì)成分等方面的差異相關(guān)。

本次3 種親和層析填料對比試驗是在MabSelect SuRe 填料優(yōu)化后的工藝基礎(chǔ)上進行的，未做過針對填料Protein A Diamond 及UniMab 50 的純化工藝優(yōu)化。適合填料MabSelect SuRe 的純化條件，對Protein A Diamond 及UniMab 50 可能并不是最優(yōu)的，很可能未達到最適的純化效果。

3 種填料親和純化樣品后，在抗體純度、電荷異質(zhì)性、殘余宿主DNA 方面表現(xiàn)相當；填料Protein A Diamond 及 MabSelect SuRe 在載量、Protein A 脫落量、殘余宿主蛋白方面表現(xiàn)相當，而UniMab 50 在這幾方面的表現(xiàn)略差一些，但其在回收率、洗脫體積及抗體濃度上表現(xiàn)更好。

綜上所述，3 種填料在抗CD52 單克隆抗體親和純化上各有優(yōu)劣，但各項參數(shù)檢測結(jié)果均在可接收范圍內(nèi)，均可滿足該步純化的要求［10］，可根據(jù)工藝狀況和質(zhì)控要求的不同進行選擇［11］。