周志軍 ，謝勇 ，岳勝蘭 ，馮璐 ，梅宇 ，胡勇，李策生 ，何彥林 ，，李陶敬 ，周東波

1.國藥集團(tuán)武漢血液制品有限公司，湖北武漢430207；2.北京天壇生物制品股份有限公司，北京100024

新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）簡稱新冠肺炎，由新型冠狀病毒（SARSCoV-2 ／ 2019-nCoV）感染引起。疫情暴發(fā)后，我國迅速進(jìn)行SARS-CoV-2 抗體檢測試劑的研制，并批準(zhǔn)用其進(jìn)行大規(guī)模檢測，對疫情防控發(fā)揮了重要作用。其中新冠病毒（2019-nCoV）IgM ／ IgG 抗體檢測試劑盒（膠體金法）是基于膠體金免疫層析技術(shù)，用于檢測人血清、血漿和指尖全血樣本中新冠病毒IgM 和IgG抗體，具有操作簡單、無需專業(yè)設(shè)備、成本低、快速（15 ～ 20 min）等特點(diǎn)，可作為 SARS-CoV-2 核酸和影像學(xué)檢測之外的一種有效補(bǔ)充檢測方法。

國內(nèi)SARS-CoV-2 抗體檢測試劑類型較多，所用抗原有重組表達(dá)的 SARS-CoV-2 的 N、RBD、S1 及全長S 蛋白的1 種或2 種的組合，導(dǎo)致各廠家試劑檢測結(jié)果不一致。目前，國際疫情仍較嚴(yán)峻，SARSCoV-2 檢測試劑缺口較大，多個(gè)廠家處于相應(yīng)診斷試劑研發(fā)和注冊申報(bào)過程中。由于陽性樣本不易獲取，多數(shù)廠家在檢測試劑研發(fā)過程中無法通過大量樣本評測來評估測試卡質(zhì)量。本研究采用COVID-19康復(fù)者恢復(fù)期滅活血漿制備的樣本盤，用于檢測多家膠體金測試卡，對其研發(fā)過程中優(yōu)化前后的測試卡進(jìn)行質(zhì)量評估，并優(yōu)化血清盤，以期提高膠體金廠家檢測測試卡的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 2019-nCoV抗體膠體金測試卡 由三諾生物傳感股份有限公司（廠家S，科研批S001、科研批S002）、杭州隆基生物技術(shù)有限公司（廠家L，科研批L001、科研批L003、科研批L005）及深圳市惠安生物科技有限公司（廠家H，科研批H001）提供。

1.2 2019-nCoV抗體檢測試劑盒 2019-nCoV IgG 抗體檢測試劑盒（ELISA）購自武漢科源安博生物技術(shù)有限公司（以下簡稱武漢科源，批號為202020217）、珠海麗珠試劑股份有限公司（以下簡稱珠海麗珠，批號為2020020308）及北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司（以下簡稱北京萬泰，批號為NCOG20200203B）；2019-nCoV IgM 抗體檢測試劑盒（ELISA）購自珠海麗珠（批號為2020020308）及北京萬泰（批號為NCOM20200205B）；2019-nCoV 總抗體檢測試劑盒（ELISA）購自北京萬泰（批號為NCOA20200204B）；2019-nCoV IgG、IgM、總抗體抗體檢測試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）購自廈門萬泰凱瑞生物技術(shù)有限公司（以下簡稱廈門萬泰，批號分別為20200301、20200305、20200311）。

1.3 抗SARS-CoV-2 抗體樣本盤的建立及優(yōu)化

1.3.1 抗體陽性樣本盤的確定 抗體陽性樣本為COVID-19 康復(fù)者（均經(jīng)SARS-CoV-2 核酸檢測為陰性）病毒滅活血漿，共423 份，均采用武漢科源和珠海麗珠2019-nCoV IgG 抗體試劑盒（ELISA）檢測。其中234 份樣本除了采用上述兩個(gè)廠家試劑盒檢測外，另采用珠海麗珠的2019-nCoV IgM 抗體檢測試劑盒（ELISA）檢測，其中88 份樣本還采用北京萬泰生產(chǎn)的 2019-nCoV 總抗體［1］、IgG、IgM 抗體試劑盒（ELISA）進(jìn)行檢測。本研究所用珠海麗珠試劑盒包被的是N 蛋白，北京萬泰和武漢科源試劑盒包被的是RBD 蛋白，兩者任一項(xiàng)檢測為陽性，均判為陽性，作為陽性盤樣本，以此標(biāo)準(zhǔn)建立的陽性血清盤樣本數(shù)為423 份（陽性樣本盤1）。

1.3.2 抗體陰性樣本盤的確定 采用職工復(fù)工篩查血清作為樣本，均經(jīng)北京萬泰和珠海麗珠的2019-nCoV IgG、IgM 抗體檢測試劑盒（ELISA）及武漢科源IgG 抗體檢測試劑盒（ELISA）初篩，并經(jīng)北京萬泰生產(chǎn)的2019-nCoV IgG、IgM 抗體、總抗體檢測試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）進(jìn)行復(fù)試。以初篩及復(fù)試均為陰性的100 份樣本作為抗體陰性樣本盤。

1.3.3 樣本盤的優(yōu)化 經(jīng)ELISA 法和化學(xué)發(fā)光法檢測，將陽性樣本盤優(yōu)化為涵蓋 IgG（+）IgM（+）56 份、IgG（+）IgM（-）30 份，合計(jì) 86 份樣本（陽性樣本盤 2）。

1.4 抗體樣本盤在2019-nCoV抗體膠體金測試卡質(zhì)量評價(jià)中的應(yīng)用

在試劑結(jié)合墊上包被膠體金標(biāo)記的羊抗雞IgY多克隆抗體和重組SARS-CoV-2 抗原，同時(shí)在NC 膜的檢測區(qū)包被鼠抗人IgG 和IgM 單克隆抗體，質(zhì)控區(qū)包被雞IgY。將樣本盤的樣本進(jìn)行編號，并標(biāo)記于測試卡上，測試卡樣本孔中加入10 μL 樣本（血漿 ／ 血清），滴加2 ～3 滴稀釋液；待測樣本中SARS-CoV-2特異性抗體與膠體金標(biāo)記的重組SARS-CoV-2 抗原結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。若樣本中含特異的SARSCoV-2 抗體，被檢測區(qū)包被的鼠抗人單克隆抗體捕獲，在檢測區(qū)形成一條肉眼可見的條帶（檢測線）；游離的膠體金標(biāo)記的羊抗雞IgY 多克隆抗體繼續(xù)向前遷移，與質(zhì)控區(qū)包被的雞IgY 發(fā)生特異性結(jié)合，在質(zhì)控區(qū)形成一條肉眼可見的條帶（質(zhì)控線）。若樣本中不含SARS-CoV-2 特異性抗體，則不出現(xiàn)檢測線，僅出現(xiàn)質(zhì)控線。根據(jù)鼠抗人IgG 和IgM 單克隆抗體包被的種類和位置，檢測線可為1 條或2 條，若兩者包被于同一位置，則檢測線為1 條。

1.4.1 廠家S 采用廠家S 科研批S001 2019-nCoV抗體膠體金測試卡（金標(biāo)抗原為重組表達(dá)SARS-CoV-2的S 和N 蛋白）檢測陽性樣本盤1（423 份）和陰性樣品盤（100 份），計(jì)算樣本盤1 和2 的檢測結(jié)果一致性，用靈敏度表示，進(jìn)行雙樣本t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)S001 批檢測結(jié)果，對膠體金測試卡進(jìn)行優(yōu)化（金標(biāo)抗原為重組表達(dá)SARS-CoV-2 的 RBD 和 N 蛋白，且上調(diào)鼠抗人 IgG 和IgM 包被濃度），即科研批S002。取陽性盤樣本盤2（86 份），陰性盤92 份樣本，用優(yōu)化后批次（科研批S002）測試卡檢測，并按下式計(jì)算準(zhǔn)確度、靈敏度、特異性及正確指數(shù)。

準(zhǔn)確度（總符合率）=（真陽性＋真陰性）／總樣本量×100%；

靈敏度= 真陽性 ／（真陽性＋假陰性）× 100%；

特異性= 真陰性 ／（真陰性＋假陽性）× 100%；

正確指數(shù)（約登指數(shù)）= 靈敏度+ 特異性- 1

1.4.2 廠家L 采用廠家L 生產(chǎn)的科研批L001 2019-nCoV 抗體膠體金測試卡（膠體金標(biāo)記抗原為重組表達(dá)的SARS-CoV-2 S1 蛋白，IgM 置于遠(yuǎn)離加樣端，IgG 置于靠近加樣端）檢測血清盤2 中20 份IgG 陽性樣本及14 份IgM 陽性樣本，計(jì)算靈敏度（公式同1.4.1 項(xiàng)）；將IgM 和IgG 檢測線順序互換后（即科研批 L003），檢測血清盤 2 中 52 份 IgG 和IgM 雙陽性樣本，計(jì)算靈敏度（公式同1.4.1 項(xiàng)），并比較靈敏度的變化。將膠體金標(biāo)記抗原改為重組表達(dá)的SARS-CoV-2 受體結(jié)合域RBD 蛋白和核殼N蛋白，加樣濃度設(shè)為 5 和 10 μL，并將 IgG 和 IgM 檢測線重合，任一抗體陽性，檢測結(jié)果即為陽性（即科研批L005）。采用科研批L005 總抗體膠體金測試卡檢測血清盤2 中73 份SARS-CoV-2 抗體陽性樣本，93 份抗體陰性樣本，評價(jià)檢測卡的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度和約登指數(shù)（公式同1.4.1 項(xiàng)）。

1.4.3 廠家H 采用廠家H 生產(chǎn)的H001 批測試卡（標(biāo)記抗原為重組表達(dá)的SARS-CoV-2 受體結(jié)合域RBD 蛋白和核殼N 蛋白）檢測104 份SARS-CoV-2抗體 IgG 陽性樣本，78 份 IgG 陰性樣本；71 份 SARSCoV-2 抗體 IgM 陽性樣本，111 份 IgM 陰性 IgG 陽性樣本，評價(jià)檢測卡的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度和約登指數(shù)（公式同1.4.1 項(xiàng)）。

2 結(jié) 果

2.1 廠家S 膠體金測試卡檢測 100 份陰性樣本檢測結(jié)果均為陰性，科研批S001 測試卡陰性背景清晰，檢測線無條帶，質(zhì)控線條帶明顯，試驗(yàn)成立，見圖1?？蒲信鶶001 測試卡檢測陽性樣本盤1 的423 份樣本中，384 份為陽性，39 份為陰性。科研批S001 測試卡的準(zhǔn)確度為92.54%，靈敏度90.78%，特異性為100.00%，約登指數(shù)為0.908，但陽性檢測線顏色淺，不易辨識，見圖2?？蒲信鶶001 測試卡檢測陽性樣本盤2 的86 份樣本中，78 份為陽性，8 份為陰性，靈敏度為90.70%，陽性樣本盤1 和2 靈敏性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 0.038，P = 0.969 7），表明可用優(yōu)化的陽性樣本盤2 代替陽性樣本盤1，縮小樣本盤，在不影響檢測結(jié)果靈敏度的情況下，大幅減少工作量，且科研批S002 上調(diào)了抗人IgG 和IgM 的包被濃度，其陽性結(jié)果顯色顏色深，清晰，易于判讀，見圖3。科研批S002 測試卡檢測陽性盤樣本2，其中82份為陽性，4 份為陰性；陰性盤92 份樣本中，91 份為陰性，1 份為陽性?？蒲信鶶002 測試卡的靈敏度為95.35%，特異性為98.91%，準(zhǔn)確度為97.19%，約登指數(shù)為0.943。

圖1 廠家S 測試卡優(yōu)化前（科研批S001）檢測陰性樣本結(jié)果Fig.1 Test result of negative samples by cassettes from manufacturer S before modification（Experimental Lot S001）

圖2 廠家S 測試卡優(yōu)化前（科研批S001）檢測陽性樣本結(jié)果Fig.2 Test result of positive samples by cassettes from manufacturer S before modification（Experimental Lot S001）

圖3 廠家S 測試卡優(yōu)化后（科研批S002）檢測陽性樣本結(jié)果Fig.3 Test result of positive samples by cassettes from manufacturer S after modification（Experimental Lot S002）

2.2 廠家L 膠體金測試卡檢測 科研批L001 測試卡檢測20 份IgG 陽性樣本的結(jié)果為陽性，且顯色明顯，見圖4；檢測14 份IgM 陽性樣本中，僅有2 份呈陽性，12 份漏檢，靈敏度極低，為14.28%，漏檢率較高，且顯色不明顯。優(yōu)化后科研批L003 測試卡檢測52 份IgG 和IgM 雙陽性樣本的結(jié)果目標(biāo)條帶顯色明顯，見圖5，檢測IgM 抗體的靈敏度為92.00%，靈敏度大幅提高?？蒲信鶯005 加樣量為5 和10 μL 的檢測結(jié)果均為陽性，前者的顯色速度慢于后者，但均可在5 min 內(nèi)顯色，見圖6，檢測卡的靈敏度98.63%，特異性99.92%，準(zhǔn)確度98.80%，約登指數(shù)0.985。結(jié)果需在15 ～20 min 進(jìn)行判定，因此樣本加入量的偏移不影響定性判斷。

圖4 廠家L 測試卡優(yōu)化前（科研批L001）檢測陽性樣本結(jié)果Fig.4 Test result of positive samples by cassettes from manufacturer L before modification（Experimental Lot L001）

2.3 廠家H 膠體金測試卡檢測 78 份IgG 陰性樣本IgG 檢測結(jié)果均為陰性，測試卡背景清晰無雜色暈染，目標(biāo)條帶顯色明顯，易于判讀，見圖7；104份IgG 陽性樣本中，102 份為陽性，2 份為陰性。測試卡檢測IgG 抗體的靈敏度為98.08%，特異性為100.00%，準(zhǔn)確度為98.90%，約登指數(shù)為0.981。111份IgM 陰性IgG 陽性樣本IgM 檢測結(jié)果均為陰性，測試卡背景清晰無雜色暈染，目標(biāo)條帶顯色明顯，易于判讀；71 份 SARS-CoV-2 抗體 IgM 陽性樣本中，60份為陽性，11 份為陰性。見圖8。測試卡檢測IgM抗體的靈敏度為84.50%，特異性為86.49%，準(zhǔn)確度為85.71%，約登指數(shù)為0.710。

圖5 廠家L 測試卡優(yōu)化后（科研批L003）檢測陽性樣本結(jié)果Fig.5 Test result of positive samples by cassettes from manufacturer L after modification（Experimental Lot L003）

圖6 廠家L 測試卡優(yōu)化后（科研批L005）檢測陽性樣本結(jié)果Fig.6 Test result of positive samples by cassettes from manufacturer L after modification（Experimental Lot L005）

圖7 廠家H 測試卡檢測IgG 陰性樣本結(jié)果Fig.7 Test result of negative samples by cassettes from manufacturer H

圖8 廠家H 測試卡檢測IgM 抗體結(jié)果Fig.8 Test result of IgM by cassette from manufacturer H

3 討 論

本研究采用的陽性樣本盤均由COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期病毒滅活血清樣本組成，所有樣本均經(jīng)SARS-CoV-2 核酸試劑檢測為陰性，且經(jīng)病毒滅活，血清盤的生物安全性具有良好保障。膠體金檢測法具有操作簡單，無需專用設(shè)備、不受場地人員限制、快速出結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)［2］。本研究發(fā)現(xiàn)，雖說明書中標(biāo)明為15 ～20 min 判定結(jié)果，但測試卡檢測陽性樣本的線條最快1 ～2 min 即可顯色，進(jìn)一步證明該方法可用于快速檢測。

研究顯示，SARS-CoV-2 感染后3 ～7 d 即可產(chǎn)生 IgM 抗體，IgG 抗體的產(chǎn)生需要 10 ～ 15 d，在感染15 d 后，總抗體檢出率達(dá)100%，抗體檢測可用于疾病輔助診斷［3-4］。由于存在窗口期，膠體金抗體檢測法不能單獨(dú)用于疾病早期診斷，但可作為核酸檢測、影像學(xué)檢測等的有效補(bǔ)充，與上述方法結(jié)合可提高臨床確診效率。本研究結(jié)果表明，陽性樣本盤IgG陽性占比明顯優(yōu)于IgM，由于IgM 是SARS-CoV-2 感染急性期產(chǎn)生，隨著患者治愈出院，IgM 滴度逐漸下降，而IgG 抗體可在機(jī)體內(nèi)存在較長時(shí)間。一項(xiàng)對SARS-CoV 的研究發(fā)現(xiàn)，感染SARS-CoV 12 年后仍可檢測到其特異性抗體［5］。

廠家S 優(yōu)化前科研批S001 金標(biāo)抗原為重組表達(dá)SARS-CoV-2 的S 和N 蛋白，檢測線顯色淺，不易辨識。雖然是定性檢測，顯色深淺與測試樣本中抗SARS-CoV-2 IgG ／ IgM 的量并無明確相關(guān)性，但檢測線讀取存在人為主觀因素，不易辨識，會(huì)造成錯(cuò)判漏判。經(jīng)本研究樣本盤測試，結(jié)果反饋給廠家進(jìn)行優(yōu)化，S002 批金標(biāo)抗原為重組表達(dá)SARS-CoV-2的RBD 和N 蛋白，且上調(diào)了抗人IgG 和抗人IgM 包被濃度。優(yōu)化后測試卡檢測線顯色深，靈敏度提升。目前多家診斷試劑生產(chǎn)廠家均已選用RBD 和N 蛋白組合以提升產(chǎn)品質(zhì)量。

廠家L 測試卡將IgM 設(shè)置于遠(yuǎn)離加樣端，IgG設(shè)置于靠近加樣端，結(jié)果IgM 檢出率極低，分析原因可能為：根據(jù)膠體金層析技術(shù)原理，IgG 分子小，移動(dòng)速度快，更易于與金標(biāo)抗原結(jié)合，IgM 分子量大，金標(biāo)抗原被IgG 結(jié)合后，導(dǎo)致IgM 結(jié)合金標(biāo)抗原量減少；在層析過程中，由于IgM 檢測線遠(yuǎn)離樣本端，金標(biāo)抗原IgM 復(fù)合物相對分子質(zhì)量較大，需要運(yùn)行距離長，金標(biāo)抗原IgG 復(fù)合物優(yōu)先被包被在靠近樣本端的IgG 檢測線的鼠抗人IgG 捕獲，形成物理屏障，導(dǎo)致金標(biāo)抗原IgM 復(fù)合物被攔截，到達(dá)檢測線的復(fù)合物量減少。廠家L 根據(jù)上述結(jié)果進(jìn)行調(diào)整，將IgM檢出線調(diào)整至IgG 檢出線下方，使IgM 檢測線靠近加樣孔端，優(yōu)化后的檢測卡IgM 檢出率明顯提升。

有研究測試了259 名感染SARS-CoV-2 有癥狀患者的早期樣本（癥狀發(fā)作后75 d 內(nèi)）和1 548 名在大流行前采集的血液樣本，SARS-CoV-2 刺突（S）蛋白的受體結(jié)合域（RBD）的早期抗體反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)顯示，在患者癥狀發(fā)作開始的14 ～28 d 間，針對RBD 的IgG、IgA 或IgM 抗體反應(yīng)均能準(zhǔn)確識別最近感染的個(gè)體，特異性均為100%，靈敏度分別為97%，91%和 81%［6］。目前，針對 SARS-CoV-2 抗體及應(yīng)用已有多項(xiàng)研究［7～10］，但新冠疫情仍在全球范圍內(nèi)持續(xù)，SARS-CoV-2 抗體檢測試劑缺口仍較大。疫情期間，我國COVID-19 確診患者在治療期，血清樣本存在病毒傳染性風(fēng)險(xiǎn)，國家衛(wèi)健委為生物安全性考慮，對醫(yī)療機(jī)構(gòu)樣本實(shí)施嚴(yán)格管控，禁止流出醫(yī)療機(jī)構(gòu)，醫(yī)療機(jī)構(gòu)承擔(dān)著疫情防控及救治患者等任務(wù)，無法滿足診斷試劑研發(fā)階段頻繁測試的需求。試劑廠家在研發(fā)診斷試劑過程中，需要多次調(diào)試優(yōu)化，各廠家無法獲得足夠的陽性樣本來調(diào)試試劑以兼顧敏感性和特異性，僅能用陰性樣本調(diào)試保證陰性正確，盡量減少假陽性，避免應(yīng)用后假陽性造成恐慌及不必要的醫(yī)療資源浪費(fèi)和干預(yù)，但由于陽性檢出率無法保證，可能造成漏檢，對傳染病疫情防控不利。

本研究采用陽性樣本盤為康復(fù)者恢復(fù)期病毒滅活血漿樣本，一方面為試劑廠家研發(fā)診斷產(chǎn)品提供支持，提高診斷試劑質(zhì)量；另一方面通過對康復(fù)者恢復(fù)期血清樣本的檢測，完善對康復(fù)者恢復(fù)期血清的質(zhì)量特征的了解，對基于血清衍生抗疫制品如COVID-19 人免疫球蛋白等防治用制劑的研發(fā)提供技術(shù)支持。膠體金測試還可作為后疫情時(shí)代大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查輔助方法之一，在未來新冠疫苗免疫效果觀察和獻(xiàn)漿員篩查中發(fā)揮作用。