沈怡 ，陳堅 ，袁克湖 ，陳才偉 ，馬東暉 ，韋彥余 ，吳易潘，任琪，劉慧博，金堅

1.無錫傲銳東源生物科技有限公司，江蘇無錫214000；2.江南大學藥學院，江蘇無錫214000

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率分別達11.6%和18.4%［1］，嚴重影響人們的身心健康。所有肺癌中，非小細胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）占 85%［2］。間變性淋巴瘤激酶（Anaplastic lymphoma kinase，ALK）基因是NSCLC 靶向治療的重要靶點［3］。其中棘皮動物微管蛋白樣4（Echinoderm microtubulin like 4，EML4）基因與 ALK 基因融合（EML4-ALK 基因）是ALK 基因重排最常見的一種形式，這種融合基因存在于NSCLC 中，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程［4］。因此，準確檢測ALK 融合狀態(tài)是ALK 陽性NSCLC 患者靶向治療的前提。另外，有研究證明，NSCLC 中ALK的狀態(tài)可能與患者的預后直接相關(guān)［5］。因此，需要一種質(zhì)量高、成本低的ALK 重排篩選的方法。

熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、全自動ALK 免疫組化化學試劑盒（Ventana IHC）及RT-PCR 是ALK 重排檢測中推薦的方法，其中FISH 是ALK 重排檢測的金標準。

CFDA 目前批準3 種用于診斷ALK 陽性NSCLC的方法，Vysis ALK Break Apart FISH 分離探針試劑盒、RT-PCR 試劑盒和全自動ALK 免疫組化化學試劑盒（Ventana IHC），三者的符合率很高［6］。而常規(guī)免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）技術(shù)簡便易行、價格便宜且操作成熟，具有作為ALK 陽性NSCLC 的初篩方法的特性［7］。針對 EML4-ALK 融合基因靶點的抑制劑，科學家進行了大量的研究，ALK 靶向治療的發(fā)展速度很快。克唑替尼是一種酪氨酸激酶受體激酶抑制劑，這種小分子抑制劑能有針對性地抑制ALK 激酶活性［8］。

常規(guī)手工 ／ 半自動IHC 檢測ALK 與FISH 檢測存在高度的一致性［9］。在IHC 檢測中使用經(jīng)濟有效且敏感的抗體對ALK 重排基因進行預篩選具有重要意義。由于進口ALK 抗體處于壟斷地位且價格昂貴，本研究以ALK 重組蛋白制備鼠抗人ALK 單抗及其試劑盒，并進行鑒定，旨在開發(fā)體外診斷ALK免疫組化試劑產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 樣本 1 162 份病理樣本蠟塊由3 家醫(yī)院提供，樣本信息見表1；NSCLC 臨床病理組織蠟塊（ALK 陰性NSCLC 及其癌旁組織、ALK 弱陽性NSCLC 組織、ALK 強陽性NSCLC 組織）由合作的醫(yī)院提供。本研究方案均獲得各醫(yī)院倫理委員會批準。

表1 病理樣本信息Tab.1 Data on clinical specimens

1.2 細胞及質(zhì)粒 肺癌細胞系293T、H2228、A549及骨髓瘤細胞SP2 ／ 0 均購自ATCC，液氮保存，使用前復蘇培養(yǎng)；質(zhì)粒 ALK（真核 ／ 原核）、COG2、LOC-387885、C7orf46、OPRM1、BCL2L11、PIP5KL1、ANXA13、PXDNL、TMPRSS4、ZFYVE27 及 SERPI NB6 均由無錫傲銳東源生物科技有限公司提供。

1.3 實驗動物 SPF 級 BALB ／ c 小鼠 4 只，雌性，6 ～8 周齡，體重約20 g，購自浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：33000800000899。

1.4 主要試劑及儀器 人ALK 重組蛋白［人ALK 重組蛋白（NP_004295）片段（1 300 ～ 1 620 aa）：系以pET23a-N-His 為載體，人 ALK 蛋白 1 300 ～ 1 620 aa基因為目的片段，通過E.coli 表達純化獲得，濃度為 0.2 μg ／ μL；目的基因為 ALK 基因全長，在其表達蛋白C-端連有DDK 標簽］及DDK 抗體由無錫傲銳東源生物科技有限公司提供；牛血清白蛋白（BSA）標準品和BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自美國Thermo 公司；F12 無血清培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；酶標羊抗鼠抗體購自美國Jackson 公司；單抗亞類檢測試劑盒SBA Clonotyping System-HRP 購自美國 Southern-Biotech 公司；抗 ALK（D5F3）兔單克隆抗體試劑（IHC 法）購自瑞士Roche 公司；抗體稀釋液分別購自美國Invitrogen 公司、基因生物科技有限公司及北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；抗原修復液及DAB 染色液（生物素-鏈霉卵白素法、聚合物法及增強聚合物法制備）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Sunrise 酶標儀購自瑞士Tecan 公司。

1.5 小鼠免疫及融合小鼠的選擇 BALB／c 小鼠4 只經(jīng)腹部皮下多點免疫人 ALK 重組蛋白，100 μL ／ 只，共免疫3 次，每次間隔2 周。初免抗原與等量弗氏完全佐劑混合；2 及3 次免疫抗原與等量弗氏不完全佐劑混合。未次免疫后1 d，取眼周血，2 720× g離心10 min，分離血清，采用ELISA 法檢測血清抗體效價。ELISA 板中包被人 ALK 重組蛋白，0.02 μg ／孔，血清倍比稀釋后37 ℃孵育1 h；加入酶標羊抗鼠抗體（1 ∶5 000 稀釋），37 ℃孵育 1 h；TMB 顯色，1 mol ／ L硫酸終止反應，用酶標儀檢測A450／ A630。選擇血清稀釋比為1 ∶12 800 時A 大于1.0 的小鼠進行細胞融合，融合前3 d 加強免疫1 次，僅免疫人ALK 重組蛋白，100 μg ／ 只。

1.6 細胞融合、陽性融合孔的篩選及陽性細胞的克隆化 取小鼠脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞，按常規(guī)方法進行細胞融合。待細胞長滿孔底1 ／ 3 后，采用間接 ELISA 及免疫細胞化學（immunocytochemical，ICC）法檢測細胞融合孔上清。ELISA 法同1.5 項，以A450／A630大于 1.0 的上清判為陽性。ICC 法：將H2228細胞接種至 96 孔板，1 × 104個 ／ 孔，依次用 4% PFA固定、3% H2O2滅活、0.1% Triton100 穿透，加入融合孔上清，37 ℃孵育1 h；加入酶標羊抗兔 ／ 鼠聚合物（DAB 染色液試劑盒組分之一），37 ℃孵育30 min；顯色反應，倒置顯微鏡下觀察細胞質(zhì)，以顯色為棕黃色的細胞判為陽性。采用有限稀釋法篩選克隆陽性細胞3 次，細胞上清的檢測及判定方法同陽性融合孔的篩選。各項檢測均以空白試劑（緩沖液）為空白對照。

1.7 ALK 單抗的制備及純化 將定株的雜交瘤細胞轉(zhuǎn)瓶，培養(yǎng)至（3 ～ 5）× 105個、細胞活率大于 90%時，11 × g 離心 5 min；棄去原培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基洗滌，置 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，10 r ／ min 轉(zhuǎn)速孵育，當雜交瘤細胞總密度≥7×105個時，2 720×g離心10 min；收集細胞上清，2 ～8 ℃保存。采用間接ELISA 法及ICC 分別檢測細胞上清的 A450／ A630和抗體特異性，方法同1.5 項。陽性細胞上清采用Protein G 親和層析方法純化。

1.8 ALK 單抗的篩選 采用IHC。將純化的單抗1A4 用抗體稀釋液稀釋為 40、20 及 10 μg ／ mL，1H7及9H5 用抗體稀釋液均稀釋為40 μg ／ mL。以空白溶劑為空白對照，對NSCLC 進行檢測。

1.9 ALK 單抗的鑒定

1.9.1 效價 采用 ELISA 法。ELISA 板包被ALK重組蛋白，0.1 μg ／ 孔。將單抗稀釋至 1 mg ／ mL，從800 倍倍比稀釋至819 200 倍，進行 ELISA 測定，方法同1.5 項。測定單抗的A450／ A630值，每孔進行3個重復，計算其CV。以A 大于1.0 的最大稀釋比為抗體效價。

1.9.2 亞型 按單抗亞類檢測試劑盒SBA Clonotyping System-HRP 說明書對單抗的Ig 類及亞類進行鑒定。

1.9.3 濃度 用BSA 標準品繪制標準曲線。將單抗樣品稀釋20 倍，加顯色液，37 ℃ 孵育30 min；酶標儀波長550 nm 處讀取吸光度值。

1.9.4 純度 單抗進行8%～20%SDS-PAGE 分析。

1.9.5 親和常數(shù) 采用間接ELISA 法。分別以1.6、0.8、0.4、0.2 μg ／ mL 人 ALK 重組蛋白包被微孔板，加入不同濃度（3.00、3.30、3.60、3.90、4.20、4.51、4.81、5.11、5.41、5.71 及 6.01 mg ／ mL）單抗及酶標羊抗鼠抗體（1 ∶1 000 稀釋）。以不同濃度單抗的A450／ A630值為縱坐標，抗體濃度負對數(shù)為橫坐標繪制曲線，計算抗體親和常數(shù)Ka。

1.9.6 特異性

1.9.6.1 Western blot 復蘇培養(yǎng) H2228、A549 及293T細胞。將質(zhì)粒 ALK、COG2、LOC387885、C7orf46、OPRM1、BCL2L11、PIP5KL1、ANXA13、PXDNL、TMPRSS4、ZFYVE27 及 SERPINB6 轉(zhuǎn)染至 293T 細胞中培養(yǎng)，將H2228、A549 及過表達的293T 細胞裂解后的細胞懸液，5 550 × g 離心 10 min，取上清，用loading buffer 混勻，95 ℃水浴 10 min；經(jīng) 8% ～ 20%SDS-PAGE 分離蛋白，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜45 min，麗春紅染色，封閉液封閉。293T 細胞分別加入DDK抗體（1 ∶1 000 稀釋）及 ALK 單抗（1 ∶2 000 稀釋），H2228 及 A549 細胞均加入 ALK 單抗（均 1 ∶5 000稀釋），40 r ／ min 室溫孵育 1 h；加入酶標羊抗鼠抗體（1 ∶5 000 稀釋），室溫孵育 1 h；曝光、顯影及定影。

1.9.6.2 IHC 將臨床病理組織石蠟片預熱、脫蠟、梯度酒精水化；EDTA 修復液（pH 8.0）120 ℃高壓修復2.5 min；3%雙氧水中滅活15 min；加入ALK 單抗（1 ∶600 稀釋），37 ℃孵育 1 h 或 2 ～ 8 ℃過夜；加入酶標羊抗兔 ／ 鼠聚合物，37 ℃孵育30 min；DAB顯色液孵育5 ～10 min，蘇木素體細胞染色液室溫復染30 s；沖洗至返藍，脫水、透明、封片，觀察組織片染色結(jié)果。

1.10 ALK 單抗免疫組織化學試劑盒配套試劑的篩選

1.10.1 抗體稀釋液 常規(guī)使用抗體稀釋液加抗體配制即用型試劑，選用美國Invitrogen 公司、基因生物科技有限公司及北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司的抗體稀釋液與單抗配制后測試其性能，使用同一病例的ALK 強陽性NSCLC 組織蠟片，比較顯色強度及背景著色情況。

1.10.2 抗原修復液及二抗系統(tǒng) 對目前最常用的3種條件抗原修復液［枸櫞酸（pH 6.0）、EDTA（pH 8.0）及 EDTA（pH 9.0）］和 3 種二抗系統(tǒng) DAB 染色液（生物素-鏈霉卵白素法、聚合物法及增強聚合物法）進行IHC 測試，使用同一病例的ALK 強陽性NSCLC組織蠟片，比較顯色強度及背景著色情況。

1.11 ALK 單抗（1A4）試劑盒與抗 ALK（D5F3）兔單抗試劑（IHC 法）比較 分別將1 162 份病理樣本蠟塊切片，HE 染色，制成芯片蠟塊，采用IHC 方法分別使用ALK 單抗試劑盒及對照試劑抗ALK（D5F3）兔單抗試劑（IHC 法）對芯片組織片進行染色，比較顯色強度及背景著色情況，并計算陽性符合率、陰性符合率及總符合率（見表2），作為試驗真實性及可靠性的評價，結(jié)果一致性分析采用Kappa 檢驗，α = 0.05檢驗水準下，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

表2 試驗結(jié)果的評價Tab.2 Evaluation of test results

2 結(jié) 果

2.1 融合小鼠的篩選 3 只小鼠血清 A450／ A630大于1.0，符合要求，1 只不合格。

2.2 ALK 單抗細胞株的篩選 細胞融合后3 ～5 d，可見克隆細胞生長；ELISA 法檢測有10 株細胞株上清 A450／ A630大于 1.0，判定為陽性；其中 3 株細胞株上清 ICC 染色呈陽性，分別命名為 1A4、1H7、9H5，見圖1。

圖 1 細胞株 1A4（A）、1H7（B）、9H5（C）上清及空白對照（D）的 ICC 染色結(jié)果（× 400）Fig.1 ICC staining results of supernatants of cell strains 1A4（A），1H7（B），9H5（C）and blank control（D）（× 400）

2.3 ALK 單抗的篩選 經(jīng)ICC 檢測，各濃度的1A4均呈強陽性，40 μg ／ mL 的 1H7 及 9H5 均呈弱陽性，見圖2。表明1A4 在NSCLC 染色中特異性較強，選擇1A4 進行后繼試驗。

圖 2 單克隆抗體1A4、1H7 及 9H5 的 IHC 染色結(jié)果（× 200）Fig.2 IHC staining results of McAbs 1A4，1H7 and 9H5（× 200）

2.4 ALK 單克隆抗體1A4 的鑒定

2.4.1 效價 結(jié)果顯示，各稀釋倍數(shù)的單抗1A4 3個重復孔A450／ A630的CV 均 ＜10%，試驗結(jié)果判定有效；單抗稀釋比為 1 ∶51 200 時，A450／ A630均值為1.029，單抗效價為 1 ∶51 200。見表 3。

2.4.2 亞型 單抗1A4 屬Ig2b 亞型。

2.4.3 濃度 BSA 標準品曲線方程為y=688.62 x-77.588，R2= 0.999 4，見圖 3。單抗 1A4 稀釋 20 倍后的 3 個復孔 A550分別為 0.602 5、0.609 1、0.605 7，濃度分別為 337.28、341.86 和 339.51 μg ／ mL。該單抗最終濃度為 6 791 μg ／ mL。

2.4.4 純度 經(jīng) 8% ～ 20% SDS-PAGE 分析，單抗1A4 在相對分子質(zhì)量約25 000 及55 000 處可見清晰的輕重鏈條帶，無雜帶，大小與預期相符，見圖4。表明抗體純化效果良好。

表3 單抗1A4 的效價檢測結(jié)果Tab.3 Determination rusult of titer of McAb 1A4

圖3 BSA 標準品的標準曲線Fig.3 Standard curve for BSA

圖4 單抗 1A4 的SDS-PAGE 分析Fig.4 SDS-PAGE profile of McAb 1A4

2.4.5 親和常數(shù) 1.6、0.8、0.4 及 0.2 μg ／ mL 人ALK 重組蛋白抗原曲線見圖5。親和常數(shù)越高表示抗原抗體結(jié)合的緊密程度越高，經(jīng)測定單抗1A4 的親和力常數(shù) Ka 為 2.75 × 109L ／ moL，表明單抗的親和力較好。

2.4.6 特異性 經(jīng)Western blot 分析，單抗1A4 僅識別ALK 蛋白，不識別ALK 之外的其他蛋白及A549細胞中的蛋白，能識別H2228 細胞系中的ALK 易位（相對分子質(zhì)量約95 000）；DDK 抗體能識別過表達ALK 全長蛋白（相對分子質(zhì)量約176 000）；單抗與11 種質(zhì)粒均不發(fā)生交叉反應。見圖6。IHC 染色顯示，ALK 陰性NSCLC、ALK 陰性癌旁組織及空白試劑染色結(jié)果均為陰性，ALK 強陽性NSCLC 組織染色結(jié)果為強陽性，ALK 弱陽性NSCLC 組織染色結(jié)果為弱陽性。表明單抗1A4 特異性較好。

圖5 單抗1A4 親和力常數(shù)測定曲線Fig.5 Curve for determination of affinity constant of McAb 1A4

2.5 單抗1A4 在免疫組織化學試劑盒中的配套試劑

2.5.1 抗體稀釋液 3 個廠家的抗體稀釋液對單抗性能的影響基本一致，均有相同強度的組織細胞質(zhì)染色，且無背景染色。選擇成本最低的中杉金橋生物科技有限公司的抗體稀釋液。

2.5.2 抗原修復液及二抗系統(tǒng) 結(jié)果顯示，9 種條件測試下的組織均為細胞質(zhì)染色，但染色強度和背景不同，EDTA 修復液（pH 9.0）與 DAB 染色液（增強聚合物法）條件下染色最強且無背景，選擇二者作為配套的抗原修復液和二抗系統(tǒng)。見表4。

2.6 ALK 單抗 1A4 試劑盒與抗 ALK（D5F3）兔單抗試劑（IHC 法）比較結(jié)果 ALK 單抗 1A4 試劑盒與抗 ALK（D5F3）兔單抗試劑（IHC 法）檢測 1 162 份樣本的ALK 陽性、陰性及總符合率均為100%。兩者的檢測及診斷定性結(jié)果一致性良好（Kappa =1.000，P ＜ 0.001）。見表 5。

圖6 各細胞裂解液中DDK 抗體及ALK 抗體特異性的Western blot 分析Fig.6 Western blotting of DDK and ALK antibodies in various cell lysates

表4 單抗1A4 配套修復液與二抗系統(tǒng)的測試結(jié)果Tab.4 Test results of repair solution and secondary antibody system matched to McAb 1A4

表 5 ALK 單抗（1A4）試劑盒及抗 ALK（D5F3）兔單抗試劑（IHC 法）檢測結(jié)果Tab.5 Detection results by ALK McAb（1A4）kit and rabbit anti-ALK（D5F3）McAb kit（IHC）

3 討 論

自 2011 年美國 FDA 及 2013 年中國 CFDA 批準克唑替尼治療ALK 陽性的局部晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC 以來，依靠 IHC 初篩 ALK 陽性的 NSCLC 病例。有研究表明［10］，克唑替尼作為NSCLC 患者的多靶點靶向治療，具有良好的療效及安全性，不良反應輕微。如患者確診為臨床ALK 陽性NSCLC，可接受克唑替尼治療。

本文通過免疫、融合、制備鼠抗人ALK 單克隆抗體，經(jīng)ELISA 和ICC 篩選出合格的雜交瘤細胞株，經(jīng)IHC 篩選得到最適的ALK 單抗。該單抗經(jīng)效價、親和常數(shù)、純度、濃度檢測及亞型和特異性鑒定，確認其特異性強。篩選出適合ALK 單抗1A4 檢測的抗體稀釋液、修復條件及二抗檢測系統(tǒng)。通過臨床病理樣本的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1A4 單抗檢測試劑盒與抗 ALK（D5F3）兔單抗試劑（IHC 法）檢測及診斷一致性良好，表明ALK 單抗（1A4）試劑盒可用于NSCLC中ALK 蛋白的檢測。

研究表明，在595 例臨床樣本對比實驗中，單抗1A4 的靈敏度優(yōu)于抗ALK（D5F3）兔單克隆抗體試劑（IHC），可防止假陰性結(jié)果的產(chǎn)生［10］。本公司以ALK 單抗（1A4）為原料，通過對產(chǎn)品配方及配套試劑與已上市的同類產(chǎn)品進行對比，開發(fā)出體外診斷試劑產(chǎn)品，即間變性淋巴瘤ALK 特異性抗體試劑，該產(chǎn)品已通過臨床實驗，成功申報注冊，已成為國內(nèi)首個上市的國產(chǎn)ALK 免疫組化試劑產(chǎn)品。相信該產(chǎn)品能以高質(zhì)量的品質(zhì)和低廉的價格替代進口產(chǎn)品，在一定程度上減輕了患者經(jīng)濟負擔，使患者能更加積極地接受治療，早日康復，獲得較高的生活質(zhì)量。