楊成園，鄧青，郭紫嬋，魏媛，王雪薇，張震，趙蓉，李孝敏，賀杰峰，王曉霞

1.山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西太原030001；2.山西白求恩醫(yī)院普外科，山西太原030032

食管癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。據(jù)2018 年全球癌癥統(tǒng)計(jì)顯示，食管癌發(fā)病率居第七位，總死亡率排名第六位［1］。目前，食管癌的治療手段主要以手術(shù)加放化療為主，化療在延長(zhǎng)患者生存期方面具有重要作用。隨著新化療藥物的上市，食管癌化療療效得到進(jìn)一步提高。但仍有部分患者無法獲益，其中化療產(chǎn)生耐藥性是導(dǎo)致臨床療效差的主要原因之一［2-3］。因此，研究化療耐藥產(chǎn)生的機(jī)制，并進(jìn)一步尋求耐藥逆轉(zhuǎn)的有效方法具有重大的臨床意義。

紫杉醇（paclitaxel，PTX）是一種廣譜的細(xì)胞毒性藥物，主要通過促進(jìn)微管蛋白聚合，使細(xì)胞在進(jìn)行有絲分裂時(shí)不能形成紡錘體和紡錘絲，從而抑制細(xì)胞分裂及增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用［4-5］。目前PTX 被廣泛應(yīng)用于各種腫瘤的臨床治療，但化療耐藥性的產(chǎn)生嚴(yán)重阻礙了其臨床療效［6-8］。因此，闡明PTX 耐藥的機(jī)制對(duì)克服耐藥具有重要的臨床價(jià)值。

建立細(xì)胞耐藥模型是體外研究腫瘤耐藥機(jī)制的前提［9］。因此，本研究首先通過體外間歇誘導(dǎo)加濃度遞增的方法模擬臨床化療耐藥產(chǎn)生的過程，建立了耐藥細(xì)胞株KYSE150 ／ PTX，并研究PTX 耐藥后對(duì)食管癌KYSE150 細(xì)胞惡性表型的影響，進(jìn)而探討其耐藥的可能機(jī)制以及導(dǎo)致化療失敗的原因。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人食管癌細(xì)胞系KYSE150 購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）購自江陰齊氏科技生物有限公司。

1.2 主要試劑 PTX 注射液購自哈藥生物工程有限公司；RPMI1640 培養(yǎng)基及胎牛血清（FBS）購自美國HyClone 公司；胰蛋白酶-EDTA 購自北京索萊寶科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）及DMSO 購自美國Sigma 公司。

1.3 PTX 耐藥細(xì)胞系的建立及細(xì)胞形態(tài)觀察 當(dāng)KYSE150 細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)，用含0.005 mg／L PTX 的培養(yǎng)基孵育 48 h；PBS 洗滌 3 遍，更換不含PTX 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，第3、27 天時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照；待細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)后，逐步提高PTX 濃度，每次均培養(yǎng)48 h 后更換不含PTX 培養(yǎng)基繼續(xù)孵育，如此反復(fù)，至細(xì)胞在 PTX 濃度為 0.05 mg ／ L 的培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，最后獲得的細(xì)胞即為PTX 耐藥細(xì)胞系（KYSE150 ／ PTX），倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.4 PTX 耐藥對(duì)細(xì)胞增殖能力影響的檢測(cè) 采用MTT 法。試驗(yàn)共設(shè)空白組、對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，每組3個(gè)復(fù)孔，其中空白組僅加入RPMI1640 培養(yǎng)基，對(duì)照組加入KYSE150 細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組加入KYSE150 ／ PTX細(xì)胞。采用MTT 法，按每孔1 000 個(gè)細(xì)胞接種至96 孔板，培養(yǎng) 1 ～ 8 d；避光加入 40 μL MTT 溶液（5 mg ／ mL），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h；吸凈 MTT 殘液，加入DMSO，100 μL ／ 孔，溶解 10 min；于酶標(biāo)儀 490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)A 值，每隔24 h 檢測(cè)1 次，共檢測(cè)8 d，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.5 PTX 耐藥對(duì)細(xì)胞克隆形成能力影響的觀察 采用克隆形成試驗(yàn)，分組見1.4 項(xiàng)。將細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，均勻接種至60 mm 培養(yǎng)皿中，1 000 個(gè)／皿，常規(guī)培養(yǎng)約 10 d；棄上清，加入甲醇，1 mL ／ 皿，靜置15 min；結(jié)晶紫染色 20 min；PBS 洗滌殘留液，拍照并計(jì)算克隆形成數(shù)目。

1.6 PTX 耐藥對(duì)細(xì)胞遷移能力影響的檢測(cè) 采用劃痕愈合試驗(yàn)，分組見1.4 項(xiàng)。將細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，接種至 60 mm 培養(yǎng)皿中，5.0 × 105個(gè) ／ 皿，細(xì)胞完全融合后用200 μL 槍尖快速劃過細(xì)胞，PBS洗滌2 次，加入1.5 mL 不含血清的培養(yǎng)基，拍照后放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再次拍照劃痕區(qū)。用Image J 軟件分析劃痕愈合情況，即分析劃痕寬度的改變并按下式計(jì)算細(xì)胞遷移率。

細(xì)胞遷移率（%）=（T0h的劃痕面積- T24h的劃痕面積）／T0h的劃痕面積 × 100%

1.7 PTX 耐藥對(duì)細(xì)胞體外小管形成能力影響的檢測(cè) 采用體外小管形成試驗(yàn)，分組見1.4 項(xiàng)。將細(xì)胞用無血清無抗生素的RPMI1640 培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞培養(yǎng)基，離心5 min 取上清。將4 ℃融化的基質(zhì)膠加入預(yù)冷的96 孔板，50 μL／孔，置孵箱30 min。消化HUVEC 細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，使其終濃度為5×104個(gè) ／ mL，鋪至提前預(yù)冷的 96 孔板中，20 μL ／ 孔，再加入細(xì)胞上清，40 μL ／ 孔，混勻，鏡下觀察小管生成情況，于6 h 后拍照并計(jì)算小管數(shù)目。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（mean ± SD）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PTX 耐藥細(xì)胞系KYSE150／PTX 的建立及形態(tài)觀察 經(jīng)過10 個(gè)月成功建立PTX 耐藥細(xì)胞系KYSE150 ／ PTX，可在含 0.05 mg ／ L PTX 的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長(zhǎng)。在藥物誘導(dǎo)過程中，KYSE150 細(xì)胞在加藥后約在第3 天開始大量死亡，殘存的少數(shù)貼壁細(xì)胞內(nèi)黑色顆粒物增多，細(xì)胞變大、不規(guī)則；但約在第27 天會(huì)出現(xiàn)新的細(xì)胞克隆，與KYSE150 細(xì)胞形態(tài)相似，體積略大；在正常傳代3 ～4 次后，細(xì)胞形態(tài)逐漸與原細(xì)胞接近。見圖1。

圖 1 KYSE150 細(xì)胞及 KYSE150 ／ PTX 細(xì)胞形態(tài)的顯微鏡觀察（× 100）Fig.1 Microscopy of morphologies of KYSE150 and KYSE150 ／ PTX cells（× 100）

2.2 PTX 耐藥對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響 結(jié)果顯示，連續(xù)培養(yǎng) 8 d，可見 KYSE150 ／ PTX 細(xì)胞 A490值均低于其親代細(xì)胞KYSE150，見圖2。表明PTX 耐藥可抑制KYSE150 細(xì)胞增長(zhǎng)。

圖2 PTX 耐藥對(duì)KYSE150 細(xì)胞增殖能力的影響Fig.2 Effect of PTX resistance on proliferation of KYSE150 cells

2.3 PTX 耐藥對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的影響 結(jié)果顯示，連續(xù)培養(yǎng)約10 d，KYSE150 細(xì)胞和KYSE150 ／PTX 細(xì)胞形成的克隆數(shù)目分別為（172.00 ± 48.50）和（33.67 ± 17.95）個(gè)，統(tǒng)計(jì)分析各組中形成的克隆團(tuán)（含至少50 個(gè)細(xì)胞）數(shù)目，兩者細(xì)胞克隆形成能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.025 6），見圖3。表明PTX耐藥可使KYSE150 細(xì)胞克隆形成能力降低。

圖3 PTX 耐藥對(duì)KYSE150 細(xì)胞克隆形成能力的影響Fig.3 Effect of PTX resistance on colony formation of KYSE150 cells

2.4 PTX 耐藥對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響 結(jié)果顯示，劃痕0 h 時(shí)，劃痕寬度接近一致，劃痕24 h 后，與KYSE150 細(xì)胞相比，KYSE150 ／ PTX 細(xì)胞劃痕已基本愈合，細(xì)胞遷移率分別為（58.79 ± 3.63）%和（87.06± 2.61）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 7），見圖4。表明PTX 耐藥后KYSE150 細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)。

圖4 PTX 耐藥對(duì)KYSE150 細(xì)胞劃痕愈合能力的影響（× 100）Fig.4 Effect of PTX resistance on wound healing of KYSE150 cells（× 100）

2.5 PTX 耐藥對(duì)細(xì)胞體外小管形成能力的影響 加入細(xì)胞上清6 h 后，與KYSE150 細(xì)胞相比，KYSE150／PTX 細(xì)胞形成的小管更多，且管腔更為完整，二者血管形成數(shù)分別為（66.70 ± 9.26）和（120.20 ±36.52）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.000 6），見圖 5。表明PTX 耐藥后血管形成能力增強(qiáng)。

圖5 PTX 耐藥對(duì)KYSE150 細(xì)胞體外小管形成能力的影響（× 100）Fig.5 Effect of PTX resistance on tubule formation of KYSE150 cells（× 100）

3 討 論

PTX 是治療食管癌的常用化療藥物，但PTX 耐藥嚴(yán)重影響了臨床療效［10］。目前，體外建立腫瘤耐藥細(xì)胞系是最經(jīng)典的研究腫瘤耐藥的方法。本研究采用低濃度藥物間歇作用加濃度遞增的誘導(dǎo)方式建立PTX 耐藥細(xì)胞。在誘導(dǎo)過程中，大多數(shù)細(xì)胞在加入藥物初期體積會(huì)增大，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)許多空泡，細(xì)胞逐漸死亡并漂浮，一段時(shí)間后極少數(shù)存活細(xì)胞開始緩慢生長(zhǎng)而后恢復(fù)指數(shù)生長(zhǎng)，最終歷時(shí)約10 個(gè)月，成功構(gòu)建PTX 耐藥細(xì)胞系，并命名為KYSE150 ／PTX 細(xì)胞。

研究發(fā)現(xiàn)，與親代細(xì)胞相比，KYSE150 ／ PTX 細(xì)胞增殖能力減弱，這與其他腫瘤耐藥系研究結(jié)果一致［11-12］。從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和克隆形成試驗(yàn)結(jié)果可以看出，KYSE150 ／ PTX 細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢，克隆形成率下降，可能是腫瘤細(xì)胞在長(zhǎng)期接受藥物刺激后做出的主動(dòng)應(yīng)激反應(yīng)，以逃避細(xì)胞免受毒性藥物的侵害［13］。劃痕愈合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PTX 耐藥可增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的劃痕愈合能力，說明PTX 耐藥后，KYSE150 細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，提示PTX 耐藥增加了腫瘤細(xì)胞的惡性表型。另外，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，血管的生成是一個(gè)及其關(guān)鍵的步驟，一方面，新生血管會(huì)長(zhǎng)入腫瘤中，為腫瘤提供充足營養(yǎng)并運(yùn)輸生長(zhǎng)因子刺激其生長(zhǎng)；另一方面，腫瘤細(xì)胞會(huì)侵入新生血管通過血液轉(zhuǎn)移至其他部位，從而引起腫瘤轉(zhuǎn)移［14］。本研究通過體外HUVEC 細(xì)胞小管形成試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PTX耐藥導(dǎo)致腫瘤血管生成能力增加，表明PTX 耐藥為腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移提供了可能。

本研究通過體外間歇誘導(dǎo)加濃度遞增的方法模擬臨床化療誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞的產(chǎn)生過程，建立了PTX耐藥細(xì)胞株KYSE150 ／ PTX，并發(fā)現(xiàn)PTX 耐藥后食管癌細(xì)胞增殖、遷移及血管生成能力發(fā)生改變，提示這些生物學(xué)表型的改變可能是PTX 耐藥影響臨床治療效果的重要因素。同時(shí)，本研究建立的穩(wěn)定PTX耐藥細(xì)胞模型為今后進(jìn)一步揭示食管癌細(xì)胞耐藥的機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。