謝青 ，房延兵 ，伊琳 ，楊銳 ，毛玉娟 ，江華 ，申進(jìn)增 ，何亞麗 ，顧遠(yuǎn)暉

1.寶雞市中醫(yī)醫(yī)院急診科，陜西寶雞721000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州730000；3.甘肅省人民醫(yī)院普外科，甘肅蘭州730000

甲狀腺癌（thyroid carcinoma）約占惡性腫瘤的1%，主要包括乳頭狀癌、濾泡狀癌、未分化癌及髓樣癌4 種病理類型，甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）約占甲狀腺癌的 80% ～ 90%［1］。隨著核輻射等危險因素影響，近年來，世界大部分地區(qū)甲狀腺癌的發(fā)病率呈快速攀升態(tài)勢［2］。在美國，65歲以上人群中甲狀腺癌發(fā)病率以年均8.8%增長［3］，中國統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，甲狀腺癌發(fā)病率呈直線上升趨勢，PTC 發(fā)病率近 26 年來增加了 5.7 倍［4］。

對于甲狀腺微小乳頭狀癌，超聲定位及穿刺活檢術(shù)在診斷運(yùn)用方面仍顯不足，找到敏感的生物學(xué)指標(biāo)更準(zhǔn)確地診斷和制定合理的治療方案是現(xiàn)在醫(yī)學(xué)發(fā)展的方向。隨著對PTC 發(fā)病機(jī)制的深入研究，生物靶向治療受到日益關(guān)注，癌癥精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)應(yīng)運(yùn)而生，通過基因組測序及大數(shù)據(jù)分析，開展的針對癌癥的精確診斷、預(yù)防及治療等能提升前期癌癥診療水平。尤其關(guān)于 BRAF 及 RAS 基因突變、RET ／ PTC基因重排、microRNA（miRNA）差異化表達(dá)等理論研究引起國內(nèi)外學(xué)者的重視。

本研究使用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)尋找PTC 癌組織及對應(yīng)癌旁正常組織差異miRNA，并預(yù)測其與PTC相關(guān)的miRNA 靶基因及功能注釋，篩查有潛在意義的miRNA 生物標(biāo)志物，為進(jìn)一步研究PTC 發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本 PTC 癌組織及對應(yīng)癌旁正常組織樣本各6 份，收集于 2016 年 5 月 ～ 2017 年 5 月甘肅省人民醫(yī)院普通外科經(jīng)手術(shù)和病理確診患者?；颊吣挲g為40 ～50 歲，癌組織選擇病灶中心部分，癌旁組織選擇手術(shù)切除病灶的對側(cè)甲狀腺組織，樣本采集后液氮冷凍及運(yùn)輸。樣本采集經(jīng)患者知情同意，并由甘肅省人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞 正常人甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori3-1（批號：BNCC337912）及人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株TPC-1（批號：BNCC340487）、k1（批號：BNCC340489）均購自上海瑟?dú)W生物科技有限公司，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)分子生物實(shí)驗室傳代培養(yǎng)。

1.3 主要試劑 細(xì)胞miRNA 超純提取試劑盒（批號：CS047A）及反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：ST1317B）購自寶生物工程（大連）有限責(zé)任公司；small RNA Sample Pre Kit 試劑盒（批號：ST1318S）、RPMI1640 培養(yǎng)基（批號：L210）、DMEM 培養(yǎng)基（批號：L110）、青霉素 ／鏈霉素雙抗（批號：S110）及胎牛血清（批號：CS047C）均購自美國GIBCO 公司；超純RNA 提取試劑盒（批號：CS047A）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 RNA 測序文庫的構(gòu)建 分別收集PTC 及癌旁正常組織樣本，按超純RNA 提取試劑盒提取并純化組織總RNA，由北京百邁克科技有限公司高通量測序?qū)嶒炇覚z測。2 種RNA 樣品純度符合檢測標(biāo)準(zhǔn)，無污染降解，符合建庫要求。對合格的樣品利用T4 RNA Ligase1 和 T4 RNA Li-gase 2（truncated）使用small RNA Sample Pre Kit 試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，并用Qubit 2.0 軟件確證檢測的正確性。庫檢合格后應(yīng)用Illumina HiSeg X Ten 平臺測序，測序讀長為singleend（SE）50 nt。

1.5 miRNA 差異表達(dá)分析 采用DESeq 1.25.9 軟件進(jìn)行2 組樣品間的miRNA 差異表達(dá)分析。用錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）作為差異表達(dá)miRNA 篩選的關(guān)鍵指標(biāo)，以差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）表示2 樣品（組）間表達(dá)量的比值，以|log2（FC）|≥1，F(xiàn)DR ≤ 0.05 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 miRNA 生物信息學(xué)分析 使用BLAST 軟件將預(yù)測靶基因序列與基因功能注釋（Gene Ontology，GO）、蛋白相鄰類的聚簇（Cluster of Orthologous Groups of proteins，COG）、真核生物蛋白相鄰鄰類的聚簇（Clusters of orthologous groups for eukaryotic complete genomes，KOG）及信號通路（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫比對，獲得靶基因的注釋信息，并對差異miRNA 進(jìn)行GO 功能注釋及KEGG 富集分析。

1.7 novel-miR-26 及 miR-124 在 Nthy-ori3-1、TPC-1和K1 細(xì)胞中表達(dá)量的驗證 采用QT-PCR 法。在培養(yǎng)瓶中，將TPC-1 及k1 細(xì)胞接種于含 10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基，Nthy-ori3-1 細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI1640 完全培養(yǎng)基，均置37 ℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)至細(xì)胞呈貼壁生長，每隔3 d 換液1 次。按細(xì)胞miRNA 超純提取試劑盒操作步驟常規(guī)提取細(xì)胞的 miRNA，用mRiNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板進(jìn)行實(shí)時定量 PCR。novel-miR-26 上游引物：5′-GGGGTCCGGCTGGGTG-3′，下游引物：5′-TATGGTTGTTCACGACTCCTTCAC-3′；miR-124 上游引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGCATT-3′，下游引物：5′-GCGGCGGTAAGGCACGCGGTG-3′；β-actin 上游引物：5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物：5′-CACCTTGCAGGCACCTTTG-3′。引物由蘇州泓迅生物科技有限公司合成。反應(yīng)條件：預(yù)變性 95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，共 40 個循環(huán)（60 → 95 ℃，每 20 s 升溫 1 ℃）。以 β-actin 作為內(nèi)參照，采用2-△△Ct計算目的基因相對表達(dá)量，平行試驗 3 次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。芯片數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，計量資料以表示，采用t 檢驗或單因素方差分析，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)miRNA 的分析 測序共獲得2 036個miRNA，已知1 591 個，新發(fā)現(xiàn)445 個。共發(fā)現(xiàn)1 166 個 miRNA 差異表達(dá)，表達(dá)上調(diào) 446 個，表達(dá)下調(diào) 720 個，深度分析發(fā)現(xiàn)，miR-124 及 miR-7 顯著下調(diào) ，miR-106a-3p、miR-494 及 novel-miR-26 顯 著 上調(diào)，見表1。

2.2 miRNA 靶基因的預(yù)測 所有樣品預(yù)測到靶基因的miRNA 有1 599 個，其中已知1 264 個，新預(yù)測335 個；預(yù)測到已知靶基因23 058 個，新預(yù)測靶基因18 203 個。對篩選出的5 個差異表達(dá)miRNA，使用百邁克平臺進(jìn)行靶基因預(yù)測篩選，部分靶基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，見表2。

表1 2 組樣品顯著差異表達(dá)的miRNATab.1 Significantly differentially expressed miRNAs in two groups

2.3 差異表達(dá)miRNA 靶基因的注釋

2.3.1 GO 分析 5 個差異表達(dá)miRNA 靶基因經(jīng)分析，生物過程（biological process，BP）主要表現(xiàn)在生物黏附、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞成分組織、單一生物過程、細(xì)胞通信、對刺激的反應(yīng)等方面；細(xì)胞組分（cell component，CC）主要表現(xiàn)在細(xì)胞連接、細(xì)胞外基質(zhì)部分、細(xì)胞外區(qū)域、大分子復(fù)合物、細(xì)胞器等方面；分子功能（molecular function，MF）主要表現(xiàn)在黏連、催化活性、載體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、分子活動等方面。見表 3 ～ 5。

表2 miRNAs 預(yù)測的部分靶基因Tab.2 Partial target genes predicted by miRNAs

表 3 GO 的 BP 分析Tab.3 GO biological process（BP）analysis

表 4 GO 的 CC 分析Tab 4.GO cell component（CC）analysis

表 5 GO 的 MF 分析Tab 5.GO molecular function（MF）analysis

2.3.2 KEGG 分析 5 個差異表達(dá)miRNA 靶基因經(jīng)分析，PTC 細(xì)胞遷移可能是miRNA 對靶基因的影響，從而調(diào)控Axon guida-nce 等相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)，PTC 細(xì)胞周期的變化可能是靶基因參與單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated kinase，AMPK）等信號通路的調(diào)節(jié)，相關(guān)靶基因可能通過氨基酸代謝、晝夜節(jié)律、蛋白消化吸收等信號通路對腫瘤細(xì)胞的凋亡發(fā)揮相應(yīng)的作用。前20 條KEGG 通路見圖1和圖2。

圖1 差異表達(dá)基因KEGG 通路富集散點(diǎn)圖Fig 1.Enrichment scatter diagram of KEGG pathway of differentially expressed genes

圖2 差異表達(dá)基因KEGG 分類Fig 2.KEGG classification of differentially expressed genes

2.4 novel-miR-26 及miR-124 的相對表達(dá)量

2.4.1 在TPC-1 及Nthy-ori3-1 細(xì)胞中的表達(dá)量 novelmiR-26 在 TPC-1 細(xì)胞中表達(dá)量（17.991 ± 1.581）較在 Nthy-ori3-1 細(xì)胞中（1.151 ± 0.318）相對高表達(dá)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 28.57，P ＜ 0.01）；miR-124在 TPC-1 細(xì)胞中的表達(dá)量（0.042 4 ± 0.009 8）較在Nthy-ori3-1 細(xì)胞中（1.971 3 ± 0.428 1）相對低表達(dá)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 11.12，P ＜ 0.01）。

2.4.2 在k1 及Nthy-ori3-1 細(xì)胞中的表達(dá)量 novelmiR-26 在 K1 細(xì)胞中表達(dá)量（10.011 ± 1.361）較在Nthy-ori3-1 細(xì)胞中（5.151 ± 2.168）相對高表達(dá)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 5.25，P ＜ 0.01）；miR-124在 k1 細(xì)胞中表達(dá)量（0.018 1 ± 0.006 4）較在 Nthyori3-1 細(xì)胞中（0.171 3 ± 0.018 1）相對低表達(dá)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 25.17，P ＜ 0.01）。

3 討 論

在PTC 臨床診療中探尋更有價值的生物分子標(biāo)志物在PTC 的術(shù)前診斷中尤為十分重要。本研究共測得2 036 個miRNA，已知1 591 個，新發(fā)現(xiàn)445個；共發(fā)現(xiàn)1 166 個miRNA 差異表達(dá)，表達(dá)上調(diào)446個，表達(dá)下調(diào)720 個，深度分析發(fā)現(xiàn)，miR-124 及miR-7 顯著下調(diào)；miR-494、miR-106a-3p 及 novel-miR-26顯著上調(diào)。這些 miRNA 可能在PTC 的發(fā)生發(fā)展，癌細(xì)胞增殖、浸潤、遷移，預(yù)后復(fù)發(fā)等方面起一定的作用。

miR-494 可能作為潛在分子標(biāo)志物運(yùn)用于臨床診斷及治療，對于個體化病情評估具有一定的意義，其參與人體疾病的發(fā)生發(fā)展過程。楊英等［5］通過對惡性及可疑惡性甲狀腺結(jié)節(jié)患者應(yīng)用PCR 檢測細(xì)針穿刺抽吸活檢（fine needle aspiration cytology，F(xiàn)NAC）標(biāo)本及外周循環(huán)中miR-191 和miR-494 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)癌組miR-191 的表達(dá)水平明顯低于良性組，而癌組miR-494 表達(dá)水平明顯高于良性組，表明miR-191 和miR-494 均可作為分子標(biāo)志物的被選基因。王克義［6］在PTC 血清臨床樣本研究中篩選了表達(dá)上調(diào)的miR-494-3p，發(fā)現(xiàn)該基因與臨床病理特征（如性別、年齡、腫瘤最大徑、病灶數(shù)量、包膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況及分期等）有關(guān)，推斷miR-494 含量的變化很可能在PTC 的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用，可作為潛在的分子標(biāo)志物進(jìn)行深入研究。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-494 不僅能抑制PTEN 表達(dá)，還能增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇3-激酶（phos-phatidylinositol3-kinase，PI3K）及 p-Akt 的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖能力、遷移力及侵襲性［7］。miR-124 是一個高保守的抑癌基因，已被證實(shí)在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程密切相關(guān)，可用于診斷或區(qū)分健康或疾病狀態(tài)的潛在分子標(biāo)志物，在診斷及預(yù)防微小PTC 中具有臨床意義。研究發(fā)現(xiàn)，與正常甲狀腺組織對比，miR-124 在癌組織中表達(dá)下調(diào)，在k1 細(xì)胞的增殖及侵襲驗證中發(fā)現(xiàn)，其作用機(jī)制可能是通過干擾miR-124 表達(dá)調(diào)控STAT3基因［8］。于佳等［9］通過檢測 PTC（K1、BCPAP 及TPC-1）細(xì)胞和人甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori 3-1 中miR-124 的相對表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，miR-124 表達(dá)均下調(diào)，其作用機(jī)制是負(fù)調(diào)控靶基因IQGAP1 的表達(dá)，改變癌細(xì)胞的增殖、遷移及凋亡。miRNA-106a 在PTC 組織中高表達(dá)，作為PTC 潛在分子標(biāo)志物，其優(yōu)點(diǎn)在于可作為臨床應(yīng)用中的敏感性及特異性指標(biāo)。最新臨床研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-106a 表達(dá)診斷 PTC 的曲線下的面積為0.838，診斷 PTC 的敏感性及特異性分別為70%和80%［10］。結(jié)合現(xiàn)有研究成果，miRNA-106a在PTC 診斷方面具有潛在的臨床應(yīng)用價值。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-7 可能是診斷甲狀腺腫瘤最準(zhǔn)確的miRNA，其優(yōu)點(diǎn)在于其可作為鑒別甲狀腺腫瘤不確定類型的輔助診斷標(biāo)志物，從而避免不必要的甲狀腺切除術(shù)，miR-7 還是區(qū)分良惡性甲狀腺FNAB 樣本的最適預(yù)測因子，其預(yù)測準(zhǔn)確率高達(dá) 76%［11］。SAISELET 等［12］發(fā)現(xiàn)，miR-7 是PTC 發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者基因中最顯著下調(diào)的miRNA。HUA 等［13］通過雙熒光素酶分析證實(shí) CKS2 為 miR-7 的靶基因，miR-7 負(fù)調(diào)控 CKS2，miR-7 可通過抑制CKS2 的mRNA 及下游蛋白的表達(dá)抑制癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲。結(jié)合相關(guān)研究miR-7 可能成為PTC 早期淋巴轉(zhuǎn)移診斷的分子標(biāo)志物，為PTC 早診斷及淋巴轉(zhuǎn)移預(yù)防方面提供了研究方向。novel-miR-26 作為此次實(shí)驗篩選的新基因，其優(yōu)點(diǎn)在表達(dá)倍數(shù)高，可備選為潛在分子標(biāo)志物，擴(kuò)充PTC 潛在分子標(biāo)志物數(shù)據(jù)庫，但缺乏文獻(xiàn)及相應(yīng)實(shí)驗數(shù)據(jù)的支持，需結(jié)合細(xì)胞、動物、臨床血清等多重驗證，證實(shí)測序結(jié)果的可靠性。此次篩選出的5 個miRNA 差異基因，為后續(xù)深入研究提供了依據(jù)。

篩選的 5 個差異表達(dá)miRNA 靶基因經(jīng)GO 富集分析，BP、CC 及 MF 主要信息提示，在 PTC 形成過程中可能是由于外界環(huán)境因素引起生物體對刺激的反應(yīng)，使生物體細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)成分改變，進(jìn)而在物質(zhì)運(yùn)輸過程中影響轉(zhuǎn)錄因子活性，影響細(xì)胞分子及酶的活性，且能造成ATP 異常，弱化機(jī)體的免疫系統(tǒng)，影響機(jī)體內(nèi)環(huán)境從而造成PTC 的發(fā)生。經(jīng)KEGG Pathway 注釋分析，KEGG 排名前 20 條通路上，顯著通路是Axon guidance 及AMPK 信號通路等。研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（pAMPK）在PTC 組織中高表達(dá)，并與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，AMPK-ACC 通路的激活在PTC 的發(fā)生及轉(zhuǎn)移中起了促進(jìn)作用［14］。AMPK 信號通路激活后可使血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和缺氧誘導(dǎo)因子1 的表達(dá)上調(diào)，從而導(dǎo)致腫瘤局部侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的加劇，缺氧還可直接激活A(yù)MPK 信號通路促使PTC 的發(fā)生發(fā)展［15-16］。在PTC 發(fā)生、發(fā)展及診療過程中，其癌組織局部微環(huán)境主要表現(xiàn)為缺血缺氧狀態(tài)，從而激活A(yù)MPK，抑制合成代謝促進(jìn)分解代謝，為腫瘤細(xì)胞的生長提供基礎(chǔ)環(huán)境。而AMPK 的激活多伴隨碘攝取能力下降，間接影響術(shù)后放射碘治療的患者的療效。結(jié)合以上相關(guān)研發(fā)現(xiàn)，AMPK 可能成為治療靶點(diǎn)，不僅可減緩PTC 的轉(zhuǎn)移及惡化，還可改善PTC 術(shù)后放射碘治療的效果。有研究發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)發(fā)育密切相關(guān)的信號通路Axon Guidance 在前列腺癌進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用［17］。甲狀腺癌位于神經(jīng)血管豐富的頸部，而Axon Guidance 在注釋的通路中排在首位，這是否提示該通路在PTC 的發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用，目前未發(fā)現(xiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報道，這為進(jìn)一步研究提供了新的思路。地域環(huán)境因素不同也是導(dǎo)致地域性甲狀腺癌發(fā)病率不同的重要因素，在已測得的通路中與代謝相關(guān)通路較多，地區(qū)水土不同可能影響正常氨基酸、脂質(zhì)、嘌呤代謝、能量代謝、生物轉(zhuǎn)化及氧化應(yīng)激等過程，上述因素為從地域角度分析PTC病因提供了新的方向。

總之，高通量測序及功能分析的一些結(jié)論僅能作為后續(xù)實(shí)驗的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，還需根據(jù)差異表達(dá)miRNA靶基因注釋篩選出顯著差異的GO 條目和 KEGG Pathway，深入挖掘基因互作關(guān)系及蛋白互作關(guān)系，分析基因與基因及其靶基因蛋白之間的關(guān)系，了解具體的基因與蛋白之間的關(guān)系，需在動物、細(xì)胞、臨床水平相互進(jìn)行驗證實(shí)驗，逐步證實(shí)這些差異基因、蛋白之間的作用機(jī)制，從精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)入手，為PTC 早期診斷及更好的防治尋找新方向。