盧煜，劉卓慧，程肖霞，解軍

山西醫(yī)科大學(xué)出生缺陷與細(xì)胞再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，山西太原030001

心肌梗死是一種嚴(yán)重的心血管疾病，在大多數(shù)情況下，是由易受損動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂或冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮糜爛引起的。近年來隨著醫(yī)療水平的不斷發(fā)展，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）及其他治療方法均可顯著提高急性心肌梗死患者的生存率。然而，這會(huì)導(dǎo)致心肌梗死患者術(shù)后發(fā)生心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)［1］。心肌梗死后心力衰竭的發(fā)展與心臟幾何結(jié)構(gòu)和功能的改變密切相關(guān)，包括炎癥反應(yīng)和瘢痕形成，也被稱為心臟重塑。心肌梗死后心臟重塑的過度和延長可導(dǎo)致心室功能受損和心力衰竭［2］。因此，更好地了解心肌梗死后的細(xì)胞和分子機(jī)制對(duì)調(diào)節(jié)心臟重塑具有重要意義。

共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因（ataxia telangiectasia mutated，ATM）編碼一種絲氨酸 ／ 蘇氨酸蛋白激酶，可被氧化應(yīng)激［3］、DNA 雙鏈斷裂［4］，或者轉(zhuǎn)化生長因子β［5］等激活，這些刺激與心肌梗死以及心肌梗死后心臟重構(gòu)有關(guān)［6-7］。但ATM 是否參與心肌梗死后心臟重塑的作用和機(jī)制尚不完全清楚。本研究通過結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支的方法構(gòu)建小鼠心肌梗死模型，利用ATM 單倍體基因缺陷小鼠以及同窩野生型小鼠探究ATM 對(duì)小鼠心肌梗死后心臟重塑的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 馬松三色染色液購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；羊血清工作液購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；蘇木素染色液購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司；Trizol 購自日本TaKaRa公司；高分辨率成像系統(tǒng)購自加拿大VisualSonics公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí) C57BL ／ 6j 背景的雄性ATM 單倍體基因敲除（ATM+／-）小鼠和同窩野生型（ATM+／+）小鼠各 30 只，10 ～ 12 周齡，體重 24 ～26 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2014-0004。

1.3 動(dòng)物分組及處理 兩種小鼠分別隨機(jī)分為假手術(shù)組和心肌梗死手術(shù)組，每組15 只。小鼠急性心肌梗死模型的建立：通過異氟烷吸入麻醉，仰臥固定小鼠四肢，在胸部左側(cè)第3 ～4 肋間隙開胸，用6-0 絲線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，最后用3-0 絲線縫合皮膚。假手術(shù)組小鼠僅開胸后縫合。

1.4 心臟超聲檢測(cè) 4 組小鼠分別在假手術(shù)或心肌梗死術(shù)后7 d，用三溴乙醇腹腔注射麻醉，仰臥固定四肢，用帶有30-MHz 超聲探頭的Vevo 2100 高分辨率成像系統(tǒng)進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，心率維持在450 ～550 次 ／ min，最后用 VisualSonics Vevo 2100 對(duì)圖像進(jìn)行分析。

1.5 心臟組織石蠟切片制備 4 組小鼠分別在假手術(shù)或心肌梗死術(shù)后7 d，用含肝素的生理鹽水灌注心臟，去除心臟中殘留血液，剪下心臟，置10%福爾馬林中固定，次日在石蠟中包埋心臟組織，Leica 石蠟切片機(jī)切片，切片厚度為5 μm，將組織切片置于多聚賴氨酸涂層載玻片上，HI1210 烤片機(jī)中60 ℃烤片2 h。

1.6 ATM 單倍體基因缺陷對(duì)小鼠心肌梗死后心臟纖維化影響的檢測(cè) 采用馬松三色染色法。將兩種小鼠心肌梗死術(shù)后7 d 的心臟組織石蠟切片脫蠟至水后，根據(jù)馬松三色染色液說明書進(jìn)行染色，尼康ECLIPSE 90i 顯微鏡采圖后，用NIS-Element 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 ATM 單倍體基因缺陷對(duì)小鼠心肌梗死后心臟組織中巨噬細(xì)胞浸潤影響的檢測(cè) 采用免疫組化染色法。將兩種小鼠心肌梗死術(shù)后7 d 的心臟組織石蠟切片脫蠟至水后，用檸檬酸抗原修復(fù)90 s，羊血清工作液封閉非特異性抗原30 min 以上；切片上滴加小鼠源 MAC2（macrophage alactose-specific lectin-2）單克隆抗體（1 ∶100 稀釋），4 ℃孵育過夜；將切片室溫平衡30 min；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，室溫孵育30 min；DAB 顯色；蘇木素染色液進(jìn)行細(xì)胞核染色；梯度酒精脫水后浸泡于二甲苯中透明20 min；中性樹膠封片晾干。尼康ECLIPSE 90i 顯微鏡采圖后，用NIS-Element 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.8 ATM 單倍體基因缺陷對(duì)小鼠心肌梗死后心臟組織膠原合成影響的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法。用Trizol 試劑從4 組小鼠心臟組織中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)。利用PrimerBLAST 進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，序列如下：CollagenⅠ上游引物：5′-GCTCCTCTTAGGGGCCACT-3′，下游引物：5′-ATTGGGGACCCTTAGGCCAT-3′；Collagen Ⅲ 上 游 引 物 ：5′-CTGTAACATGGAAACTGGGGAAA-3′，下游引物：5′-CCATAGCTGAACTGAAAACCACC-3′。引物由蘇州泓迅生物科技有限公司合成。反應(yīng)體系：2 × SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各 1 μL，DEPC 水 7 μL，cDNA 1 μL，總體系20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，共 45 個(gè)循環(huán)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad-Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ATM 單倍體基因缺陷對(duì)小鼠心肌梗死后心功能的影響 超聲結(jié)果顯示，心肌梗死術(shù)后7 d，ATM+／-小鼠射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）和縮短分?jǐn)?shù)（frac-tional shortening，F(xiàn)S）明顯低于 ATM+／+小鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t 分別為 2.497 和 2.167，P 分別為0.023 1 和0.048），見圖 1。表明 ATM 單倍體基因缺陷加重了心肌梗死后7 d 小鼠的心功能惡化。

圖1 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)假手術(shù)或心肌梗死術(shù)后ATM+／-小鼠及 ATM+／+小鼠 EF（A）和 FS（B）的變化Fig.1 Detection of EF（A）and FS（B） of ATM+ ／ - and ATM+ ／+mice after sham operation of MI by echocardiography

2.2 ATM 單倍體基因缺陷對(duì)小鼠心肌梗死后心臟纖維化的影響 馬松三染色結(jié)果顯示，心肌梗死術(shù)后 7 d，ATM+／-小鼠心臟纖維化水平明顯高于 ATM+／+小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 2.519，P = 0.0453），見圖2 和圖3。

2.3 ATM 單倍體基因缺陷對(duì)小鼠心肌梗死后心臟組織中巨噬細(xì)胞浸潤的影響 免疫組化染色結(jié)果顯示，心肌梗死術(shù)后 7 d，ATM+／-小鼠及 ATM+／+小鼠心臟組織中巨噬細(xì)胞浸潤水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 1.331，P = 0.2315），見圖 4 和圖 5。

2.4 ATM 單倍體基因缺陷對(duì)小鼠心肌梗死后心臟組織膠原合成的影響 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示，心肌梗死術(shù)后 7 d，ATM+／-小鼠 collagenⅠ和collagenⅢ mRNA 水平均明顯高于 ATM+／+小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t 分別為 10.73 和 3.001，P 分別為 0.000 4 和 0.024），見圖 6。

圖2 馬松三色染色法檢測(cè)心肌梗死術(shù)后7 d 小鼠心臟纖維化水平（× 10）Fig.2 Detection of cardiac fibrosis in mice by Masson trichrome staining（× 10）

圖3 心肌梗死術(shù)后7 d 小鼠心臟纖維化面積統(tǒng)計(jì)Fig.3 Area of cardiac fibrosis of mice 7 d after MI

圖4 心肌梗死術(shù)后7 d 小鼠心臟組織免疫組化染色的顯微鏡觀察（× 400）Fig.4 Immunohistochemical staining of cardiac tissue of mice 7 d after MI（× 400）

圖5 心肌梗死術(shù)后7 d 小鼠心臟組織Mac2 陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比Fig 5.Percentage of Mac2 positive cells in total cells in cardiac tissue of mice 7 d after MI

圖6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)假手術(shù)或心肌梗死術(shù)后ATM+ ／ -小鼠及 ATM+ ／ +小鼠心臟組織中 collagenⅠ（A）和collagenⅢ（B）mRNA 水平Fig 6.Determination of collagenⅠ（A）and collagenⅢ（B）mRNA levels in cardiac tissue of ATM+ ／- and ATM+ ／+ mice after sham operation or MI by real-time fluorescent quantitative PCR

3 討 論

ATM 是對(duì)DNA 損傷應(yīng)答的激酶，導(dǎo)致共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥（ataxia telangiectasia，AT），具有多種炎癥表現(xiàn)。ATM 在正常淋巴細(xì)胞發(fā)育中起作用［8］，參與粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony stimulating factor，GM-CSF）誘導(dǎo)的骨髓樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）的發(fā)展［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死術(shù)后 7 d，ATM+／-小鼠與 ATM+／+小鼠相比，巨噬細(xì)胞浸潤無明顯差異。心肌缺血誘導(dǎo)心肌氧化應(yīng)激和活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，直接損害細(xì)胞成分并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此外，ROS 還刺激炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，促進(jìn)左心室擴(kuò)張和心力衰竭［6，10］。ATM 是ROS［3］的重要傳感器，同時(shí)維持 ROS 平衡［11］。本研究表明，ATM 單倍體基因缺陷加重了心肌梗死后心功能惡化，可能是由心肌梗死后的ROS 失衡導(dǎo)致。

心臟纖維化是許多心臟疾病常見的病理生理學(xué)特征，與收縮和舒張功能障礙、心律失常等不良結(jié)局有關(guān)，心肌纖維化決定心肌梗死后的心臟功能。肌成纖維細(xì)胞母細(xì)胞介導(dǎo)心肌梗死后的瘢痕形成，分泌細(xì)胞外基質(zhì)組分，包括Ⅰ型膠原α1（collagen type I alpha 1，COL1A1）、Ⅰ型膠原 α2（COL1A2）、Ⅲ型膠原 α1（collagen type Ⅲ alpha 1，COL3A1）和基質(zhì)金屬蛋白酶，從而導(dǎo)致纖維化瘢痕，影響心肌梗死后心功能［12］。本研究結(jié)果表明，ATM+／-小鼠心肌梗死后心臟纖維化加重、心臟組織膠原沉積增加。

綜上所述，ATM 單倍體基因缺陷加重小鼠心肌梗死后心臟不良重塑，促進(jìn)心臟纖維化和膠原沉積，但不影響心臟組織中巨噬細(xì)胞浸潤。