李國秀 ，歐云文 ，馬炳 ，李茜 ，代軍飛 ，丁耀忠 ，劉磊 ，張杰

1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，甘肅蘭州730046；3.開江縣動物疫病預(yù)防控制中心，四川達(dá)州636250

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）主要分為3 個基因型，即 PCV1、PCV2 和 PCV3［1-2］，PCV2 屬無囊膜的、單股、環(huán)狀、負(fù)鏈DNA 病毒，為已知最小的動物病毒之一，是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）、皮炎和腎病綜合征（porcine dermatitis and nephropathy synd-rome，PNDS）的主要病原［3］。臨床特征為壞死性淋巴結(jié)炎、急性肺水腫、生殖障礙及肉芽腫性腸炎，嚴(yán)重制約全球養(yǎng)豬業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展［4-5］。PCV2包括 PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d 及 PCV2e 基因亞型，其中PCV2b 是中國豬群中主要流行的基因亞型［1，6］。PCV2 病毒粒子呈球形，直徑 12 ～ 23 nm，基因組大小約為1 760 bp，含11 個開放閱讀框（open reading frame，ORF），其中 ORF1、ORF5、ORF7 及 ORF-10 位于病毒基因組正鏈，其他ORF 位于基因組互補(bǔ)鏈。ORF1 編碼病毒復(fù)制蛋白，即 Rep 蛋白［1，7-8］；ORF2 編碼病毒衣殼蛋白，即Cap 蛋白，該蛋白由233 ～234 個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約278 000，其N-端富含堿性氨基酸，序列高度保守。Cap 蛋白前41個氨基酸是核定位信號肽序列，第69 ～83 位和第117 ～131 位氨基酸是Cap 蛋白的2 個主要特異性抗原表位［9-10］。麥芽糖結(jié)合蛋白（matlose binding protein，MBP）作為重要的標(biāo)簽蛋白，可融合在蛋白的N-或C-端，增強(qiáng)細(xì)菌中過表達(dá)融合蛋白的溶解性，屏蔽毒性蛋白。同時，MBP 標(biāo)簽純化技術(shù)采用麥芽糖溫和洗脫，無去污劑或變性劑對蛋白活性的影響。

本研究以PCV2b 亞型 Cap 蛋白編碼基因的優(yōu)化序列為目的片段，采用pMAL-C4x 原核表達(dá)系統(tǒng)可溶性表達(dá)MBP-Cap 融合蛋白，并對其進(jìn)行純化和免疫原性分析，以期為PCV2b 病毒樣顆粒（virus like particle，VLP）的體外組裝及診斷試劑盒的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及質(zhì)粒 感受態(tài)大腸埃希菌BL21（DE3）、DH5α 由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室保存；His-Sumo-PCV2b-Cap-pUC57 重組質(zhì)粒由上海玉博生物科技有限公司合成；pMAL-C4x 載體購自美國NEB 公司。

1.2 實驗動物 SPF 級 BALB ／ c 小鼠，12 只，雄性，6 周齡，體重17 ～20 g，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（甘）-2015-0001。

1.3 主要試劑及儀器 DNA marker、蛋白質(zhì)marker、EcoRⅠ及PstⅠ限制性內(nèi)切酶、Ex-Taq DNA 聚合酶均購自寶生物工程（大連）有限公司；直鏈淀粉樹脂及兔抗MBP-tag 多克隆抗體購自美國NEB 公司；PCV2b 陽性豬血清購自美國VMRD 公司；質(zhì)粒小量制備試劑盒、DNA 膠回收試劑盒及PCR 清潔試劑盒均購自美國AxyPrep 公司；IPTG 及氨芐西林購自北京索萊寶生物科技有限公司；HRP 標(biāo)記的兔抗豬IgG、山羊抗兔IgG 及弗氏完全 ／ 不完全佐劑均購自德國Sigma 公司；蛋白胨、酵母提取物購自英國OXOID公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.4 引物設(shè)計及合成 以PCV2 毒株（CAU0673）基因組為參考序列，His-Sumo-PCV2b-Cap-pUC57 重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計特異性引物，上游引物：5′-CGGAATTCCACCACCACCACCACCATGGTAGCGGT-3′（下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點）；下游引物：5′-AACTGCAGTTACGGGTTCAGCGGCGGATCTTTC-3（′下劃線部分為PstⅠ酶切位點）。引物由西安擎科生物科技有限公司合成。

1.5 目的片段PCV2-Cap-pUC57 的擴(kuò)增 以His-Sumo-PCV2b-Cap-pUC57 重組質(zhì)粒為模板，PCR 擴(kuò)增1 047 bp 目的片段。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共 35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，以ddH2O 作為陰性對照。凝膠回收目的片段，-20 ℃保存。

1.6 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 采用EcoRⅠ及PstⅠ分別雙酶切pMAL-C4x 載體和PCR 凝膠回收產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物經(jīng)T4 連接酶16 ℃連接過夜；取連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化于感受態(tài)大腸埃希菌 DH5α 及 BL21（DE3），涂布于終濃度為0.3 mmol ／ L 氨芐西林抗性的LA 平板，37 ℃培養(yǎng)12 h；挑取單菌落接種于LB 培養(yǎng)液，37 ℃，200 r ／ min 培養(yǎng) 8 h；5 800 × g 離心 5 min，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR 及酶切鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送蘇州金唯智（GENEWIZ）生物科技有限公司測序，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pMAL-C4x-PCV2b-Cap。

1.7 融合蛋白MBP-Cap 的表達(dá)及可溶性分析 將重組表達(dá)菌 BL21（DE3）接種于 LB 培養(yǎng)液，37 ℃振蕩培養(yǎng)約 2 h，菌液 A600為 0.6 ～ 1.0 時，優(yōu)化表達(dá)條件，進(jìn)行IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)。IPTG 終濃度設(shè)為0.5、1 及 1.5 mmol ／ L；誘導(dǎo)溫度設(shè)為 16、28 及 37 ℃；誘導(dǎo)時間設(shè)為 6、12 及 24 h。5 800 × g 離心 5 min收菌，1 × PBS 懸浮洗滌 3 次，菌體進(jìn)行 8% SDSPAGE 分析，以未誘導(dǎo)的菌體及pMAL-C4x 空載體為對照。適量過柱緩沖液Buffer C（1 mmoL ／ L Tris-HCl，0.2 moL ／ L NaCl 及 1 mmoL ／ L EDTA）懸浮誘導(dǎo)后的菌體，冰浴超聲裂解20 min，9 800 × g 離心10 min，收集上清裂解液及沉淀，經(jīng)8% SDS-PAGE分析融合蛋白的表達(dá)形式。

1.8 融合蛋白MBP-Cap 的純化 按直鏈淀粉樹脂使用說明書，取適量直鏈淀粉樹脂，制備蛋白純化層析柱，并采用5 倍柱體積的過柱緩沖液Buffer C平衡樹脂柱3 次，上清裂解液與直鏈淀粉樹脂4 ℃結(jié)合6 h，控制流速為2 mL ／ min，將流穿液重復(fù)上柱結(jié)合1 ～2 次；用15 倍柱體積的過柱緩沖液Buffer C 洗滌雜蛋白，再用8 倍柱體積的10 mmoL ／ L 的麥芽糖緩沖液洗脫目的蛋白，收集流穿液（分別標(biāo)記為C1 ～C10階段），測定各流穿液A280，并進(jìn)行8% SDS-PAGE分析，收集含有目的蛋白的流穿液，PBS 緩沖液超濾置換。

1.9 融合蛋白MBP-Cap 純化產(chǎn)物的分析 采用Western blot 法。純化的融合蛋白MBP-Cap 經(jīng)8%SDS-PAGE 分離，轉(zhuǎn)印至 2 張 PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別加入PCV2b 陽性豬血清（1 ∶100稀釋）及兔抗 MBP-tag 多克隆抗體（1 ∶2 000 稀釋），4 ℃，70 r ／ min 搖床孵育過夜；1 × PBST 洗滌 5 次，10 min ／ 次；分別加入 HRP 標(biāo)記的兔抗豬 IgG（1 ∶6 000 稀釋）及山羊抗兔 IgG（1 ∶5000 稀釋），室溫?fù)u床孵育 1 h；1 × PBST 洗滌 5 次，避光顯色 1 min，暗室曝光，同時設(shè)pMAL-C4x 空載體為陰性對照。

1.10 動物免疫 選取12 只健康的BALB／c 小鼠，其中4 只放血致死，制備空白對照血清；其余8 只分為融合蛋白MBP-Cap 組及PBS 組，每組4 只，經(jīng)背部多點皮下注射，共免疫4 次，間隔14 d。融合蛋白MBP-Cap 組免疫劑量50 μg／只，首次及加強(qiáng)免疫時，分別與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑等量乳化；PBS 組免疫劑量為 0.2 mL ／ 只。末次免疫 7 d后，放血致死，制備血清，-20 ℃保存。

1.11 免疫小鼠血清抗體特異性的檢測 采用Western blot 法。融合蛋白MBP-Cap 經(jīng)8% SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉過夜，分別以制備的2 組小鼠抗血清及空白對照血清為一抗（1 ∶500 稀釋），HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG 為二抗（1 ∶6 000 稀釋），避光顯色 1 min，暗室曝光，同時設(shè)pMAL-C4x 空載體為陰性對照。

2 結(jié) 果

2.1 PCV2-Cap-pUC57 目的片段的鑒定 PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1 條1 047 bp 的目的片段，大小與預(yù)期一致，見圖1。

圖1 PCV2b-Cap-pUC57 片段的PCR 鑒定Fig.1 Identification of PCV2b-Cap-pUC57 gene fragment by PCR

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 重組質(zhì)粒pMAL-C4x-PCV2b-Cap 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1 047 bp 的目的片段，大小與預(yù)期一致，陰性對照無目的條帶，見圖2；重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1 047 bp 的目的基因片段及6 645 bp的pMAL-C4x 載體片段，大小與預(yù)期一致，而陰性對照無目的條帶，見圖3。測序結(jié)果表明pMAL-C4x-PCV2b-Cap 重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析 在不同誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度下，目的蛋白表達(dá)量無明顯差異，選擇終濃度為 1 mmol ／ L 的 IPTG，37 ℃誘導(dǎo) 6 h為誘導(dǎo)表達(dá)條件。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)8% SDS-PAGE 分析，融合蛋白MBP-Cap 主要以可溶性形式存在，相對分子質(zhì)量約81 000，大小與理論值一致，見圖4。

2.4 純化融合蛋白MBP-Cap 的分析 經(jīng)直鏈淀粉樹脂純化，融合蛋白MBP-Cap 主要存在于C2 流穿液，其中在C1 ～C4 階段出現(xiàn)較集中的洗脫峰，見圖5和圖6。

圖2 重組質(zhì)粒PCR 產(chǎn)物的鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmids by PCR

圖3 重組質(zhì)粒pMAL-C4x-PCV2b-Cap 的雙酶切（EcoRⅠ／PstⅠ）鑒定Fig.3 Restriction map of recombinant plasmid pMAL-C4x-PCV2b-Cap（EcoRⅠ／ PstⅠ）

圖4 融合蛋白MBP-Cap 的SDS-PAGE 分析Fig.4 SDS-PAGE profile of MBP-Cap fusion protein

圖5 純化融合蛋白MBP-Cap 的SDS-PAGE 分析Fig.5 SDS-PAGE profile of purified MBP-Cap protein

圖6 洗脫液蛋白濃度Fig.6 Protein concentration of eluants

2.5 融合蛋白MBP-Cap 的鑒定 經(jīng)Western blot分析，純化融合蛋白MBP-Cap 與PCV2b 陽性豬血清及兔抗MBP-tag 多克隆抗體均發(fā)生特異性反應(yīng)，于相對分子質(zhì)量約81 000 處出現(xiàn)特異性蛋白條帶，而pMAL-C4x 空載體無特異性條帶，見圖7。表明該蛋白具有較好的反應(yīng)原性。

圖7 純化融合蛋白MBP-Cap 的Western blot 分析Fig.7 Western blotting of purified MBP-Cap protein

2.6 免疫小鼠血清的抗體特異性 經(jīng)Western blot 分析，融合蛋白MBP-Cap 組在相對分子質(zhì)量約81 000處出現(xiàn)特異性的蛋白條帶，PBS 組、空白血清對照組及pMAL-C4x 空載體均無條帶，見圖8。表明融合蛋白MBP-Cap 可與免疫小鼠血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具有較好的免疫原性。

圖8 免疫小鼠血清的Western blot 分析Fig 8.Western blotting of antisera of immunized mice

3 討 論

Cap 蛋白作為一種免疫相關(guān)性蛋白，在病毒入侵宿主細(xì)胞及復(fù)制過程中起重要作用［11］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，PCV2 通過Cap 蛋白與宿主細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，由網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞［12］。因此，Cap 蛋白常作為 PCV2 分子病原學(xué)、致病機(jī)理及診斷技術(shù)等研究的靶蛋白［13］。國內(nèi)外學(xué)者先后采用真核及桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)等表達(dá)Cap蛋白，為Cap 蛋白的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)［14-15］。

本研究前期采用包涵體形式原核表達(dá)，Ni-NTA 樹脂親和層析純化，不同濃度尿素復(fù)性，獲得了較高純度的重組Cap 蛋白，但需對純化后蛋白進(jìn)行復(fù)性處理［16］。大腸埃希菌具有生長速度快、培養(yǎng)經(jīng)濟(jì)快捷、表達(dá)水平高、待選質(zhì)粒及宿主多等特點，是常用的蛋白表達(dá)系統(tǒng)，但外源蛋白在大腸埃希菌中高水平表達(dá)的同時，容易被宿主蛋白酶降解或形成包涵體。因此，探索外源蛋白在大腸埃希菌中的可溶性表達(dá)具有較高的學(xué)術(shù)價值以及廣泛的應(yīng)用前景。pMAL 系列載體含有mal E 信號序列，引導(dǎo)融合蛋白穿過胞質(zhì)膜，進(jìn)入周質(zhì)，實現(xiàn)蛋白的可溶性表達(dá)，進(jìn)而有利于形成二硫鍵，促進(jìn)蛋白折疊。

本實驗以PCV2 毒株（CAU0673）基因組為參考序列，His-Sumo-PCV2b-Cap-pUC57 重組質(zhì)粒為模板，PCR 擴(kuò)增并構(gòu)建pMAL-C4x-PCV2b-Cap 重組表達(dá)載體，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，直鏈淀粉樹脂純化，進(jìn)而實現(xiàn)融合蛋白MBP-Cap 的原核可溶性表達(dá)，該融合蛋白相對分子質(zhì)量約81 000，純化后可與PCV2b 陽性豬血清、兔抗MBP-tag 多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，表明其具有良好的反應(yīng)原性。以純化的融合蛋白MBP-Cap 免疫 BALB ／ c 小鼠，制備免疫小鼠血清，可與融合蛋白MBP-Cap 發(fā)生特異性反應(yīng)，表明該融合蛋白具有良好的免疫原性。

綜上所述，本實驗成功構(gòu)建了pMAL-C4x-PCV2b-Cap 重組表達(dá)載體，可溶性誘導(dǎo)表達(dá)出融合蛋白MBPCap，純化后的融合蛋白具有較好的免疫原性。該蛋白可用于PCV2b 疫苗及診斷制劑的研發(fā)，為PCV2b的防控及診斷奠定了理論基礎(chǔ)。