易力，鄒俊如，喬燕，何云龍，樊會(huì)青，李琦涵，王晶晶

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明650118

流行性腮腺炎是一種由腮腺炎病毒（mumps virus）引起的傳染性疾病，腮腺炎病毒的傳播通常以空氣飛沫為載體［1］，這就導(dǎo)致了該病的高傳播率及較高的發(fā)病率［2］。腮腺炎病毒感染通常引起患者雙側(cè)或單側(cè)的腮腺腫大，感染人群中有20%的青年男性可發(fā)生單側(cè)睪丸炎，5%的青年女性可發(fā)生卵巢炎，而在總的感染發(fā)病者中，并發(fā)無(wú)菌性腦膜炎的可達(dá)15%，并發(fā)胰腺炎的約5%，并發(fā)腦炎的可能性約為1 ／ 6 000，并發(fā)單側(cè)永久性耳聾的可能比例為1 ／15 000，另外還有一些偶發(fā)的并發(fā)關(guān)節(jié)炎、心肌炎及肝炎等［3-5］。以我國(guó)2018 年CDC 公布的全國(guó)法定傳染病疫情為例，全國(guó)丙類(lèi)傳染病報(bào)告發(fā)病數(shù)居前5位的病種占丙類(lèi)傳染病報(bào)告發(fā)病總數(shù)的99.80%，其中流行性腮腺炎報(bào)告發(fā)病數(shù)居第4 位，發(fā)病率為18.65 ／ 10 萬(wàn)［6］。對(duì)接種腮腺炎疫苗后的人群進(jìn)行調(diào)查顯示，抗體血清陽(yáng)性率較低，接種疫苗后的人群對(duì)腮腺炎的免疫力降低［7-8］。21 世紀(jì)以來(lái)，病毒性腮腺炎疫情持續(xù)增加，2016 — 2017 年出現(xiàn)了腮腺炎暴發(fā)的情況［9-11］。我國(guó)做為廣泛使用腮腺炎疫苗的國(guó)家，居高不下的腮腺炎發(fā)病率也已引起廣泛關(guān)注［12］。

根據(jù)大量流行病學(xué)資料分析，我國(guó)目前使用最多的腮腺炎減毒活疫苗毒株主要是A 基因型，但對(duì)我國(guó)腮腺炎患者的基因?qū)W分析發(fā)現(xiàn)，大部分患者感染的病毒主要為F 基因型［13］。因此，在腮腺炎病毒疫苗的研制及使用中，與流行株基因型相同的毒株將具有更加重要的流行病學(xué)意義。本研究利用細(xì)胞工廠，使用F 基因型腮腺炎減毒活疫苗毒種SP-A 株，接種于人二倍體細(xì)胞KMB17，連續(xù)制備6 批減毒活疫苗，并對(duì)不同階段產(chǎn)品進(jìn)行有效性、安全性和殘余物質(zhì)檢測(cè)，以分析在細(xì)胞工廠上生產(chǎn)F 基因型腮腺炎減毒活疫苗的質(zhì)量穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及毒種 人二倍體細(xì)胞 KMB17 株（32代）由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供；腮腺炎病毒SP-A 株為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所于2005 年分離，經(jīng)全基因測(cè)序?yàn)镕 基因型（基因庫(kù)登錄號(hào)：DQ 649478），本研究使用的毒株為24 代。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)ICR 小鼠（體重18 ～22 g）和清潔級(jí)Hartley 豚鼠（體重250 ～330 g）由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部提供。

1.3 主要試劑及儀器 MEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；新生牛血清購(gòu)自蘭州民海生物工程有限公司；胰蛋白酶和谷氨酰胺購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；凍干穩(wěn)定劑由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所配制；無(wú)菌檢查用培養(yǎng)基購(gòu)自北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司；鱟試劑購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司；牛血清白蛋白殘留量檢測(cè)Cygnus 試劑盒購(gòu)自北京西美杰科技有限公司；硫酸卡那霉素殘留量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京勤邦生物技術(shù)有限公司；10 層細(xì)胞工廠購(gòu)自美國(guó)康寧公司；96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；集菌儀購(gòu)自默克密理博公司；無(wú)菌隔離器購(gòu)自上海東富龍愛(ài)瑞思科技有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司。

1.4 F 基因型腮腺炎減毒活疫苗的制備 連續(xù)制備6 批腮腺炎減毒活疫苗（每批次12 個(gè)細(xì)胞工廠），編號(hào)為1 ～6。將KMB17 細(xì)胞在細(xì)胞工廠中傳代，（37 ± 0.5）℃培養(yǎng) 3 ～ 5 d，待細(xì)胞長(zhǎng)為單層時(shí)，將腮腺炎病毒SP-A 株按MOI 0.02 接種于KMB17 細(xì)胞，（37 ± 0.5）℃培養(yǎng) 6 ～ 8 d 收獲病毒，即為病毒收獲液；病毒收獲液經(jīng)（50 μm + 10 μm）兩級(jí)澄清過(guò)濾后，即為病毒原液；將病毒原液與凍干穩(wěn)定劑混合后即為半成品；半成品經(jīng)分裝、凍干后，制備為腮腺炎減毒活疫苗成品。

1.5 質(zhì)量檢定

1.5.1 疫苗有效性檢測(cè) 采用微量細(xì)胞病變法對(duì)病毒收獲液、原液、半成品和成品進(jìn)行病毒滴度檢測(cè)：將樣品10 倍系列稀釋?zhuān)≈辽? 個(gè)稀釋度的病毒液接種KMB17 細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接種 8 孔，0.10 mL ／ 孔，置（37 ± 0.5）℃培養(yǎng)10 d，判定結(jié)果。并對(duì)成品進(jìn)行熱穩(wěn)定試驗(yàn)：將成品在37 ℃條件下放置7 d 后檢測(cè)病毒滴度。

1.5.2 疫苗安全性檢測(cè) 按照《中國(guó)藥典》三部（2015 版）要求對(duì)成品進(jìn)行無(wú)菌、細(xì)菌內(nèi)毒素和異常毒性檢查。

1.5.3 疫苗殘余物質(zhì)檢測(cè) 按照《中國(guó)藥典》三部（2015 版）要求對(duì)成品進(jìn)行牛血清白蛋白和抗生素殘留量檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 對(duì)6 批中間產(chǎn)品的病毒滴度，6 批成品的病毒滴度、熱穩(wěn)定性試驗(yàn)、牛血清白蛋白殘留量、抗生素殘留量4 個(gè)指標(biāo)，應(yīng)用minitab 17 軟件進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布（P ＞0.05）的數(shù)據(jù)利用其均值及標(biāo)準(zhǔn)差，繪制2 倍標(biāo)準(zhǔn)差控制線（standard deviation line，± 2 SL）和 3 倍標(biāo)準(zhǔn)差控制線［控制圖中用上控制線（upper control line，UCL）和下控制線（lower control line，LCL）表示］，分析各階段產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性。

2 結(jié) 果

2.1 病毒滴度 檢測(cè)結(jié)果顯示，病毒收獲液和原液病毒滴度均值均＞5.9 LgCCID50／ mL；將原液稀配為半成品后，病毒滴度下降 0.3 ～ 0.5 LgCCID50／ mL；再將半成品進(jìn)行凍干后，成品滴度也有所下降，下降范圍在 0.4 ～ 0.6 LgCCID50／ mL；熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果符合《中國(guó)藥典》三部（2015 版）要求。對(duì)所有階段制品的病毒滴度檢測(cè)值分別進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，檢測(cè)數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布（P ＞0.05），見(jiàn)表1，且在正負(fù)2 倍標(biāo)準(zhǔn)差控制線范圍內(nèi)波動(dòng)，見(jiàn)圖1。

2.2 疫苗的安全性 6 批成品的無(wú)菌及異常毒性檢查結(jié)果均為陰性，細(xì)菌內(nèi)毒素均不超過(guò)50 EU ／ 劑。

2.3 疫苗的殘余物質(zhì) 檢測(cè)結(jié)果顯示，6 批成品的牛血清白蛋白和抗生素殘留量均低于50 ng ／ 劑，分別對(duì)兩組檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，檢測(cè)數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布（P ＞0.05），見(jiàn)表2，所有數(shù)據(jù)均在正負(fù)2 倍標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi)波動(dòng)，見(jiàn)圖2。

表1 各階段產(chǎn)品的病毒滴度范圍及正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Test results of virus titer and normality of products in various stages

圖1 病毒收獲液（A）、原液（B）、半成品（C）、成品（D）及成品熱穩(wěn)定性試驗(yàn)（E）的病毒滴度變化趨勢(shì)Fig.1 Trend of virus titer of virus harvest（A），bulk（B），final bulk（C），final product（D）and the final product in thermal stability test（E）

表2 成品的殘余物質(zhì)數(shù)據(jù)（ng ／ 劑）及正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Test results of residual substance and normality of final product（ng ／ dose）

圖2 成品牛血清白蛋白（A）和抗生素（B）殘留量變化趨勢(shì)Fig.2 Trend of residual BSA（A）and residual antibiotics（B）contents in final product

3 討 論

本研究對(duì)在細(xì)胞工廠上生產(chǎn)的F 基因型腮腺炎減毒活疫苗進(jìn)行了質(zhì)量穩(wěn)定性分析，使用的毒株與國(guó)內(nèi)主要流行的腮腺炎病毒基因型相同，這將對(duì)預(yù)防和控制腮腺炎的流行起到重要作用［14］，該毒株已通過(guò)Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)研究，證明其對(duì)易感人群具有較好的有效性［15］，此外，使用人二倍體細(xì)胞生產(chǎn)，也證明其具有較好的安全性［16］。

本研究利用細(xì)胞工廠在人二倍體細(xì)胞基質(zhì)上制備了6 批F 基因型腮腺炎減毒活疫苗。首先，從疫苗的有效性指標(biāo)來(lái)分析，病毒收獲液和原液的病毒滴度均值均高于5.9 LgCCID50／ mL；在疫苗制備過(guò)程中，將原液稀配為半成品，病毒滴度下降0.3 ～0.5 LgCCID50／ mL；將半成品凍干為成品，病毒滴度下降 0.4 ～ 0.6 LgCCID50／ mL；成品病毒滴度均不低于4.0 LgCCID50／ mL；熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果符合《中國(guó)藥典》三部（2015 版）［17］要求，病毒滴度下降不高于1.0 LgCCID50／ mL，且仍不低于 4.0 LgCCID50／ mL。每個(gè)階段產(chǎn)品的病毒滴度檢測(cè)值均為正態(tài)分布，且在2 倍標(biāo)準(zhǔn)差控制限范圍內(nèi)波動(dòng)，每個(gè)生產(chǎn)過(guò)程的病毒滴度變化均在可接受范圍內(nèi)，表明整個(gè)制備過(guò)程工藝穩(wěn)定，可獲得病毒滴度穩(wěn)定的病毒收獲液、原液、半成品和疫苗成品。病毒滴度作為衡量疫苗質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該生產(chǎn)工藝穩(wěn)定。其次，從疫苗的安全性指標(biāo)來(lái)分析，成品的無(wú)菌、異常毒性檢查均為陰性，細(xì)菌內(nèi)毒素均不高于50 EU／劑，檢測(cè)結(jié)果符合《中國(guó)藥典》三部（2015 版）要求（細(xì)菌內(nèi)毒素應(yīng)不高于50 EU ／ 劑）。再?gòu)囊呙绲臍堄辔镔|(zhì)指標(biāo)來(lái)分析，牛血清白蛋白和抗生素殘留量檢測(cè)結(jié)果均符合《中國(guó)藥典》三部（2015 版）要求（牛血清白蛋白和抗生素殘留量均應(yīng)不高于50 ng ／劑），所有檢測(cè)數(shù)據(jù)均在2 倍標(biāo)準(zhǔn)差控制限范圍內(nèi)波動(dòng)。6 批成品牛血清白蛋白殘留量最高值為35.1 ng ／ 劑，成品抗生素殘留量最高值為14.4 ng ／ 劑，與《中國(guó)藥典》規(guī)定值比較，均不高于上限值。無(wú)菌試驗(yàn)、異常毒性試驗(yàn)、細(xì)菌內(nèi)毒素、牛血清白蛋白殘留量和抗生素殘留量這5 個(gè)檢測(cè)指標(biāo)反應(yīng)了該生產(chǎn)工藝能夠穩(wěn)定生產(chǎn)出安全性可靠的疫苗成品。

本研究利用細(xì)胞工廠在人二倍體細(xì)胞基質(zhì)上制備了F 基因型腮腺炎減毒活疫苗，能獲得質(zhì)量穩(wěn)定的中間產(chǎn)品和成品，生產(chǎn)過(guò)程中不同階段的病毒滴度變化也較穩(wěn)定，安全性指標(biāo)和殘留物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果也證明該工藝適用于該疫苗的生產(chǎn)。本研究結(jié)果為F 基因型腮腺炎減毒活疫苗（人二倍體細(xì)胞）的規(guī)模化生產(chǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。