馬 喆，謝凱莉，龔慕辛

白芍非藥用部位芍頭中單萜苷類有效部位的制備工藝研究

馬 喆，謝凱莉，龔慕辛*

首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069

優(yōu)化白芍非藥用部位芍頭中單萜苷類有效部位的提取及純化工藝。以芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等單萜苷類成分以及非單萜苷類成分苯甲酸、沒(méi)食子酸的含量為指標(biāo)，采用歸一化處理得到總評(píng)歸一值（overall desirability，OD）；以提取時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)作為乙醇提取的關(guān)鍵工藝參數(shù)，運(yùn)用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法建立OD與工藝參數(shù)之間的數(shù)學(xué)模型，推算芍頭回流提取的最佳工藝，并進(jìn)行驗(yàn)證。在單因素試驗(yàn)確定大孔樹(shù)脂型號(hào)的基礎(chǔ)上，以上樣體積流量、上樣液質(zhì)量濃度、柱徑高比、洗脫體積流量作為純化的關(guān)鍵工藝參數(shù)，采用可考察交互作用的正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取液純化工藝，并進(jìn)行驗(yàn)證。芍頭回流提取的優(yōu)選工藝為加12倍量50%乙醇提取2次，每次80 min；3次工藝驗(yàn)證的OD為2.61、2.49、2.57，RSD為2.5%。以D-101型大孔吸附樹(shù)脂純化，0.25 g/mL藥液上樣，上樣體積流量為0.5 mL/min，徑高比為1∶4，最大上樣量為3 BV，2 BV去離子水除雜，4 BV 50%乙醇以1 mL/min體積流量洗脫。3次純化工藝驗(yàn)證綜合評(píng)分分別為0.733 3、0.702 4、0.729 7，RSD為2.3%；單萜苷總轉(zhuǎn)移率為74.17%，純化物中單萜苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為59.85%。得到的提取和純化工藝高效且穩(wěn)定，可除去芍頭中大部分非單萜苷成分，獲得單萜苷類有效部位。

芍頭；星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法；正交設(shè)計(jì)；提取工藝；純化工藝；大孔樹(shù)脂；單萜苷類；沒(méi)食子酸；氧化芍藥苷；芍藥內(nèi)酯苷；芍藥苷；沒(méi)食子酰芍藥苷；苯甲酸；苯甲酰芍藥苷；歸一化

白芍為常用大宗藥材，為毛茛科芍藥屬植物芍藥Pall.的干燥根，主要含有芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷等單萜及其苷類成分、齊墩果酸等三萜及其苷類、鞣質(zhì)類、黃酮類、多糖類、揮發(fā)油類等[1]。白芍以主根入藥，其根莖和側(cè)根凸頭俗稱“芍頭”，在秋季采收時(shí)常常作為下腳料被削去，屬于非藥用部位，干芍頭的年產(chǎn)量保守估計(jì)有1800～3100 t。已有研究發(fā)現(xiàn)芍頭中的芍藥苷含量遠(yuǎn)高于主根[2]，且與白芍有效成分的種類沒(méi)有明顯差異[3]。據(jù)課題組前期調(diào)研，目前有將芍頭藥用或代替白芍提取有效成分的做法。為充分利用芍藥非藥用部位，促進(jìn)中藥資源合理、合規(guī)的使用，針對(duì)芍頭中單萜苷類成分為主的有效成分進(jìn)行提取和純化工藝優(yōu)化與驗(yàn)證，以達(dá)到盡可能保留該類有效成分，去除非單萜苷類成分的目的。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1260高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；MSA124S-1CE-DU電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；KQ 5200DE型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；FW 100型粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；J1811252旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，北京西沖科技發(fā)展有限公司。

1.2 材料

芍頭采集于白芍主產(chǎn)區(qū)安徽亳州井泉藥業(yè)白芍種植基地，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院羅容副教授鑒定為毛茛科芍藥屬植物芍藥Pall.的干燥根莖。對(duì)照品沒(méi)食子酸（批號(hào)BD09A038，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、氧化芍藥苷（批號(hào)A08A0177，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、沒(méi)食子酰芍藥苷（批號(hào)AF71101-05，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、苯甲酰芍藥苷（批號(hào)AF71101-02，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、芍藥苷（批號(hào)AF71101-01，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司；對(duì)照品芍藥內(nèi)酯苷（批號(hào)S-011-180908，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司；對(duì)照品苯甲酸（批號(hào)Z18S7H21155，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

D-101型大孔樹(shù)脂（批號(hào)120613）、AB-8型大孔吸附樹(shù)脂（批號(hào)140611）購(gòu)自天津市海光化工有限公司；HP-20大孔樹(shù)脂（批號(hào)20190518）購(gòu)自安徽三星樹(shù)脂有限公司；HPD-500型大孔樹(shù)脂（批號(hào)M0058-500）、NKA-9型大孔樹(shù)脂（批號(hào)524D011）、S-8型大孔樹(shù)脂（批號(hào)313A011）均購(gòu)自北京虹湖聯(lián)合化工產(chǎn)品有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，購(gòu)自Fisher公司；磷酸為分析純，購(gòu)自北京化工廠；95%藥用乙醇購(gòu)自宏發(fā)化工有限公司；純凈水購(gòu)自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC法同時(shí)測(cè)定芍頭提取物中7種成分含量

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒(méi)食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、沒(méi)食子酰芍藥苷、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷7種對(duì)照品適量，用甲醇溶解并定容，得到含沒(méi)食子酸103.0 μg/mL、氧化芍藥苷48.5 μg/mL、芍藥內(nèi)酯苷368.0 μg/mL、芍藥苷1 122.8 μg/mL、沒(méi)食子酰芍藥苷44.4 μg/mL、苯甲酸41.6 μg/mL、苯甲酰芍藥苷54.0 μg/mL的混合對(duì)照品母液，依次稀釋得到不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取芍頭最粗粉（過(guò)10目篩）25 g，置于500 mL圓底燒瓶中，按照星點(diǎn)設(shè)計(jì)不同方案進(jìn)行提取，抽濾并在60 ℃水浴下減壓濃縮至無(wú)醇味，加相應(yīng)的提取溶劑轉(zhuǎn)移并定容至生藥質(zhì)量濃度1 g/mL，再稀釋得到生藥質(zhì)量濃度0.01 g/mL溶液，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 色譜條件 色譜柱為Kromasil 100-5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～10 min，5%～13%乙腈；10～25 min，13%～15%乙腈；25～40 min，15%～18%乙腈；40～45 min，18%～20%乙腈；45～50 min，20%～50%乙腈；50～55 min，50%乙腈；55～60 min，50%～100%乙腈；60～65 min，100%乙腈；體積流量1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：0～10 min，275 nm；10～18 min，258 nm；18～47 min，230 nm；47～50 min，280 nm；50～65 min，230 nm；柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。理論塔板數(shù)按芍藥苷計(jì)算不低于2000?；旌蠈?duì)照品與樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

1-沒(méi)食子酸 2-氧化芍藥苷 3-芍藥內(nèi)酯苷 4-芍藥苷 5-沒(méi)食子酰芍藥苷 6-苯甲酸 7-苯甲酰芍藥苷

1-gallic acid 2-oxypaeoniflorin 3-albiflorin 4-paeoniflorin 5-galloylpaeoniflorin 6-benzoic acid 7-benzoylpaeoniflorin

圖1 混合對(duì)照品(A) 與芍頭樣品(B) 的HPLC圖

Fig. 1 HPLC of mixed reference substances (A) and rhizome ofsample (B)

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以各成分色譜峰峰面積作為縱坐標(biāo)（），對(duì)照品中各成分的質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。表明各成分在各自線性范圍呈良好線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 將混合對(duì)照品母液稀釋2倍，精密吸取稀釋后的混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，并計(jì)算各成分峰面積的RSD值，沒(méi)食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、沒(méi)食子酰芍藥苷、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷峰面積的RSD值分別為0.26%、0.27%、0.22%、0.38%、0.20%、0.40%、0.35%，各成分峰面積的RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一芍頭樣品6份，分別照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值，沒(méi)食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、沒(méi)食子酰芍藥苷、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷峰面積的RSD值分別為1.4%、2.7%、2.6%、2.7%、3.0%、2.3%、2.9%，各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件于0、2、4、6、8、12、24、36、48 h進(jìn)樣，計(jì)算各成分峰面積的RSD值，沒(méi)食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、沒(méi)食子酰芍藥苷、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷峰面積的RSD值分別為0.97%、2.73%、0.30%、0.73%、0.89%、0.48%、0.35%，各成分在48 h內(nèi)峰面積的RSD均小于3%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定1.25 g樣品粉末6份，分別精密加入與樣品中各成分含量相等的對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法提取并定容，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，續(xù)濾液按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算得出7種成分沒(méi)食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、沒(méi)食子酸芍藥苷、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷的平均加樣回收率分別為101.6%、103.0%、99.3%、102.3%、126.7%、102.3%、98.68%，RSD分別為1.3%、1.2%、2.7%、1.8%、1.5%、1.6%、1.8%，均符合要求。

2.2 芍頭中各成分含量的測(cè)定

精密稱取4份芍頭細(xì)粉（過(guò)60目篩）約0.1 g，分別加入10%、30%、50%、70%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，回流提取1 h，冷卻后補(bǔ)足質(zhì)量，過(guò)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算各成分含量。由于不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取液中各成分含量不同，取最高值計(jì)算芍頭中各成分含量。

測(cè)得實(shí)驗(yàn)用芍頭中各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為沒(méi)食子酸8.110 mg/g、氧化芍藥苷1.044 mg/g、芍藥內(nèi)酯苷10.31 mg/g、芍藥苷42.24 mg/g、沒(méi)食子酰芍藥苷3.061 mg/g、苯甲酸2.121 mg/g、苯甲酰芍藥苷1.446 mg/g。

2.3 提取工藝的優(yōu)化

2.3.1 單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)研究 結(jié)合白芍提取的相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果[4-12]，確定對(duì)提取方法及是否粉碎進(jìn)行考察，并以提取次數(shù)、提取時(shí)間、料液比、溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)作為單因素實(shí)驗(yàn)考察因素，對(duì)各因素范圍進(jìn)行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用乙醇回流提取時(shí)，單萜苷類成分提取率遠(yuǎn)高于水回流提取及乙醇超聲提取，且粉碎后各成分提取率明顯優(yōu)于不粉碎時(shí)的提取率。提取2次時(shí)提取效果優(yōu)于提取1次和3次的效果；提取時(shí)間為1.5、2.0 h時(shí)的提取效果相近且優(yōu)于提取1.0、2.5 h；料液比為1∶6和1∶10時(shí)的提取效果相近且略優(yōu)于1∶14時(shí)，料液比為1∶14時(shí)提取效果明顯優(yōu)于1∶20，料液比小于1∶6時(shí)溶劑體積難以覆蓋藥物；70%乙醇提取效果略高于50%乙醇，且兩者效果優(yōu)于40%、60%、80%乙醇，考慮到乙醇體積分?jǐn)?shù)較高會(huì)明顯增加大生產(chǎn)時(shí)的提取成本，因此后續(xù)主要研究較低體積分?jǐn)?shù)乙醇的提取工藝。

2.3.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)研究 在前期單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定芍頭粉粹過(guò)10目及乙醇回流提取2次。同時(shí)確定了提取時(shí)間（1）、料液比（2）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（3）3個(gè)關(guān)鍵因素，提取時(shí)間的極值確定為1 h和2.5 h，料液比的極值確定為1∶6和1∶14，乙醇體積分?jǐn)?shù)的極值確定為30%和60%，因素和水平見(jiàn)表2，提取方法見(jiàn)“2.1.2”項(xiàng)。

2.3.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果 以7種成分的含量（）作為指標(biāo)，采用Hassan法對(duì)各正向成分（氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、沒(méi)食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷）以及負(fù)向成分（沒(méi)食子酸和苯甲酸）的提取率進(jìn)行歸一化處理得到歸一值（min）和（max）[13]。

＝/

min＝(max－Y)/(max－min)

max＝(Y－min)/(max－min)

為芍頭中各成分含量（mg/g），為供試品溶液中各成分的質(zhì)量濃度（mg/mL），為稀釋倍數(shù)，為樣品溶液體積（mL），為芍頭粉末質(zhì)量（g）

根據(jù)芍頭提取物中各成分的含量比例進(jìn)行主觀賦權(quán)，各成分權(quán)重系數(shù)（）依次為沒(méi)食子酸＝0.075，氧化芍藥苷＝0.05，芍藥內(nèi)酯苷＝0.20，芍藥苷＝0.50，沒(méi)食子酰芍藥苷＝0.05，苯甲酸＝0.075，苯甲酰芍藥苷＝0.05。將各成分歸一值與相應(yīng)權(quán)重系數(shù)乘積相加得到總評(píng)歸一值（OD），星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)與結(jié)果見(jiàn)表3。

OD＝0.075沒(méi)食子酸＋0.050氧化芍藥苷＋0.200芍藥內(nèi)酯苷＋0.500芍藥苷＋0.050沒(méi)食子酰芍藥苷＋0.075苯甲酸＋0.050苯甲酰芍藥苷

2.3.4 模型擬合 采用Design-expert軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到擬合方程及效應(yīng)圖，擬合方程：OD＝2.36－0.0421＋0.212＋0.403＋0.01712＋0.01013＋0.06623－0.02312－0.1622－0.2532。對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4，效應(yīng)圖見(jiàn)圖3。模型值＜0.005（差異顯著），失擬項(xiàng)的＞0.05（差異不顯著），表明該模型擬合效果較好。預(yù)測(cè)極大值為1＝1.35 h，2＝1∶11.79，C＝54.00%時(shí)，OD最大，為2.61。考慮到實(shí)際生產(chǎn)情況，將優(yōu)化提取條件定為提取時(shí)間（1）＝80 min，料液比（2）＝1∶12，乙醇體積分?jǐn)?shù)（3）＝50%。

2.3.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照“2.3.4”項(xiàng)中的優(yōu)化條件提取3份25 g芍頭，測(cè)定7種指標(biāo)成分含量，并計(jì)算OD值，結(jié)果見(jiàn)表5。得到OD值分別為2.61、2.49、2.57，RSD為2.5%。實(shí)際值與擬合方程得到的OD預(yù)測(cè)值2.61相比較，兩者基本一致，說(shuō)明所建立的模型擬合度高，預(yù)測(cè)性良好。

2.4 純化工藝的優(yōu)化

2.4.1 上樣液的制備 取25 g芍頭粗粉，按照“2.3.4”項(xiàng)中的優(yōu)化條件提取，提取液濃縮后加水定容至相應(yīng)質(zhì)量濃度。

2.4.2 大孔樹(shù)脂型號(hào)的篩選 經(jīng)查閱文獻(xiàn)報(bào)道[14-21]，確定了待篩選樹(shù)脂的種類：D-101、HP-20、HPD-500、AB-8、NKA-9、S-8型大孔樹(shù)脂。

（1）靜態(tài)吸附的考察：將預(yù)處理好的各種型號(hào)樹(shù)脂用濾紙快速吸干表面水分，分別稱取2.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入5 mL去離子水使其濕潤(rùn)，再精密加入10 mL芍頭提取液（生藥0.25 g/mL），每隔8 h超聲5 min，24 h后抽濾，并以100 mL去離子水洗滌樹(shù)脂，洗滌液與抽濾液合并后定容至250 mL作為吸附后液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。向樹(shù)脂中加入50%乙醇溶液80 mL，每隔8 h超聲振動(dòng)5 min，24 h后抽濾，并用50%乙醇洗滌，抽濾液和洗滌液合并后定容至250 mL即為解吸液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。總評(píng)分靜態(tài)吸附率評(píng)分與靜態(tài)解吸率評(píng)分之和，靜態(tài)吸附率評(píng)分和靜態(tài)解吸率評(píng)分分別為各成分吸附率、解吸率與前述相應(yīng)成分權(quán)重系數(shù)（非單萜苷類成分權(quán)重系數(shù)為負(fù)）乘積之和，公式如下，評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表6。

靜態(tài)吸附率（）＝1－11/00

靜態(tài)解吸率（）＝22/(00－11)

靜態(tài)吸附率評(píng)分＝?0.075沒(méi)食子酸＋0.050氧化芍藥苷＋0.200芍藥內(nèi)酯苷＋0.500芍藥苷＋0.050沒(méi)食子酰芍藥苷－0.075苯甲酸＋0.050苯甲酰芍藥苷

A-提取時(shí)間和料液比對(duì)提取效果影響 B-提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果影響 C-料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果影響

表5 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

靜態(tài)解吸率評(píng)分＝?0.075沒(méi)食子酸＋0.050氧化芍藥苷＋0.200芍藥內(nèi)酯苷＋0.500芍藥苷＋0.050沒(méi)食子酰芍藥苷－0.075苯甲酸＋0.050苯甲酰芍藥苷

總評(píng)分＝靜態(tài)吸附率評(píng)分＋靜態(tài)解吸率評(píng)分

0為原溶液中各成分質(zhì)量濃度，1為吸附后液中各成分質(zhì)量濃度，2為解吸液中各成分質(zhì)量濃度，0為原溶液體積，1為吸附后液體積，2為解吸液體積

結(jié)果表明，6種樹(shù)脂中綜合評(píng)分最高的是非極性大孔樹(shù)脂D-101，其次是大孔樹(shù)脂AB-8、HPD-500、HP-20和NKA-9，故淘汰S-8型大孔樹(shù)脂，采用其他5種樹(shù)脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附考察。

（2）動(dòng)態(tài)吸附的考察：取同樣規(guī)格的色譜柱（直徑1.5 cm，長(zhǎng)30 cm），分別裝入上述5種樹(shù)脂各10 mL，取芍頭提取液（生藥0.25 g/mL）各20 mL，分別以1 mL/min的體積流量上樣，先用50 mL去離子水洗脫，再依次用10%、30%、50%、70%、95%乙醇各30 mL洗脫，洗脫體積流量為1 mL/min，分別收集各部分洗脫液，加去離子水定容至250 mL，其他各部分洗脫液用同濃度乙醇液定容至100 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。比較5種型號(hào)大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)洗脫率并進(jìn)行綜合評(píng)分，評(píng)分方法同“2.3.3”項(xiàng)。結(jié)果見(jiàn)表7。

動(dòng)態(tài)吸附率（）＝(00－22－33)/00

各體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液動(dòng)態(tài)洗脫率（W）＝CV/00

總洗脫率（總）＝10%＋30%＋50%＋70%＋95%

0為原溶液中各成分質(zhì)量濃度，2為上樣吸附后流出液中各成分質(zhì)量濃度，3為水洗脫液中各成分質(zhì)量濃度，C為各體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫液中各成分質(zhì)量濃度，0為原溶液體積，2為上樣吸附后流出液體積，3為水洗脫液體積，V為各濃度乙醇洗脫液體積

綜合考慮動(dòng)、靜態(tài)吸附結(jié)果，選擇D-101、AB-8 2種樹(shù)脂進(jìn)行進(jìn)一步考察。同時(shí)發(fā)現(xiàn)使用D-101、AB-8 2種樹(shù)脂，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于50%后，氧化芍藥苷、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、沒(méi)食子酰芍藥苷等大部分成分總洗脫率基本不變，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用50%乙醇進(jìn)行洗脫。

2.4.3 最大上樣量的比較 取同樣規(guī)格的色譜柱（直徑1.5 cm，長(zhǎng)30 cm）2根，分別裝入D-101、AB-8大孔樹(shù)脂各10 mL，取芍頭提取液（生藥0.25 g/mL）分別以1 mL/min的體積流量通過(guò)樹(shù)脂柱，分段收集殘留液并定容至25 mL作為吸附后液，前50 mL每10 mL收集1次，以后每5 mL收集1次，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。發(fā)現(xiàn)D-101樹(shù)脂上樣至4 BV時(shí)，芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷已經(jīng)開(kāi)始明顯泄露，因此最大上樣量為3 BV；AB-8樹(shù)脂上樣至3 BV時(shí)，芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷已經(jīng)明顯開(kāi)始泄露，因此最大上樣量為2 BV。因此，選擇D-101大孔樹(shù)脂對(duì)芍頭提取物進(jìn)行純化。

2.4.4 純化工藝單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)研究 結(jié)合白芍提取液純化文獻(xiàn)結(jié)果，確定以洗脫劑用量、柱徑高比、上樣液質(zhì)量濃度、上樣體積流量、洗脫體積流量作為單因素實(shí)驗(yàn)考察因素，并對(duì)各因素范圍進(jìn)行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，為了盡量保存單萜苷類有效成分，除去糖類等雜質(zhì)，選用20 mL水除雜，40 mL 50%乙醇進(jìn)行洗脫。柱徑高比為1∶4時(shí)，純化效果最好，其吸附率和洗脫率均高于柱徑高比為1∶10和1∶1。在一定范圍內(nèi)，上樣質(zhì)量濃度越小時(shí)純化效果越好，但質(zhì)量濃度過(guò)小會(huì)導(dǎo)致純化速度降低，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇0.25、0.5 g/mL。在一定范圍內(nèi)，上樣體積流量越小時(shí)純化效果越好，但上樣速度過(guò)慢過(guò)會(huì)導(dǎo)致純化效率降低，因此，確定0.5 mL/min為上樣體積流量。在所選擇的洗脫體積流量中，當(dāng)洗脫體積流量為1 mL/min及0.75 mL/min時(shí)純化效果較好。

2.4.5 正交試驗(yàn) 在“2.4.4”項(xiàng)預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定了純化工藝各影響因素范圍的同時(shí)，考慮上樣液質(zhì)量濃度（A）與上樣體積流量（B）容易有交互作用，當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度增大時(shí)，上樣速度容易變慢，從而影響上樣時(shí)間及吸附效果，因此，采用可考察交互作用的正交試驗(yàn)表L8(42)進(jìn)行優(yōu)化工藝的篩選，實(shí)驗(yàn)安排見(jiàn)表8，重復(fù)3次，洗脫率計(jì)算公式同“2.4.2”項(xiàng)，綜合評(píng)分為洗脫率與相應(yīng)成分權(quán)重系數(shù)乘積之和，計(jì)算方法同“2.3.3”項(xiàng)。

結(jié)果見(jiàn)表9，采用SPSS 16.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表10?？梢钥闯?，洗脫體積流量（C）和徑高比（D）2因素對(duì)純化結(jié)果具有顯著性影響，因素重要性順序?yàn)镃＞D＞B＞A＞A×B，最佳上樣條件為A1B1C2D2，即當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為生藥0.25 g/mL，上樣體積流量為0.5 mL/min，洗脫體積流量為1 mL/min，徑高比為1∶4時(shí)純化效果最好。

*2＝0.464 (adjusted2＝0.316)

綜合評(píng)分＝0.075沒(méi)食子酸＋0.050氧化芍藥苷＋0.200芍藥內(nèi)酯苷＋0.500芍藥苷＋0.050沒(méi)食子酰芍藥苷＋0.075苯甲酸＋0.050苯甲酰芍藥苷

2.4.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照“2.4.5”項(xiàng)中的最優(yōu)純化條件純化3份芍頭提取液，洗脫率計(jì)算公式同“3.2.3”項(xiàng)，洗脫率及綜合評(píng)分見(jiàn)表11，綜合評(píng)分分別為0.733 3、0.702 4、0.729 7，RSD為2.3%。以每克芍頭純化后所含各成分質(zhì)量/芍頭中各成分的含量計(jì)算轉(zhuǎn)移率，芍頭中各成分的含量見(jiàn)“2.2”項(xiàng)，3次重復(fù)試驗(yàn)的平均轉(zhuǎn)移率分別為沒(méi)食子酸0.28%、氧化芍藥苷36.32%、芍藥內(nèi)酯苷121.95%、芍藥苷66.34%、沒(méi)食子酰芍藥35.35%、苯甲酸38.58%、苯甲酰芍藥苷71.77%、白芍總單萜苷74.17%。提取物純化干燥后總單萜苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為59.85%，苯甲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.14%，沒(méi)食子酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%。

3 討論

芍藥中的苯甲酸會(huì)增加肝臟的解毒負(fù)擔(dān)，含量不宜過(guò)高[22]；沒(méi)食子酸為非單萜苷類成分，因此苯甲酸和沒(méi)食子酸為評(píng)價(jià)指標(biāo)中的負(fù)向成分。氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷為白芍總苷類有效成分[23]，沒(méi)食子酰芍藥苷具有抗炎、抗?jié)兗懊庖哒{(diào)節(jié)等作用[24]，這5種成分是正向成分。

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)提取效果較為50%及70%均差，分析原因是指標(biāo)成分較多，各成分極性不同，因此乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取效果的關(guān)系呈M型。在提取過(guò)程中，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)低于40%時(shí)，會(huì)出現(xiàn)大量絮狀物質(zhì)，導(dǎo)致后續(xù)過(guò)濾困難，提示大生產(chǎn)使用低體積分?jǐn)?shù)乙醇不適宜，同時(shí)不宜使用60%乙醇。

考察純化工藝時(shí)，提取液濃縮至無(wú)醇味并用水定容至1 g/mL后，久置會(huì)產(chǎn)生少許沉淀，搖勻后加水稀釋成其他質(zhì)量濃度后沉淀會(huì)減少，上樣過(guò)程中樹(shù)脂上層會(huì)有少量沉淀，但用乙醇洗脫后沉淀溶解，不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的洗脫速度和洗脫時(shí)間。

采用優(yōu)化工藝得到的提取液干浸膏得率為36.8%，單萜苷類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.86%，因此需要進(jìn)一步純化。已有研究中常用來(lái)純化白芍提取物的大孔樹(shù)脂大多為非極性樹(shù)脂，更利于除去提取物中的糖類成分。本實(shí)驗(yàn)中，采用2 BV水可將提取液中大部分多糖等雜質(zhì)洗脫，且僅洗脫下少量芍藥苷。相比使用50%乙醇，70%乙醇除苯甲酸和苯甲酰芍藥苷外對(duì)其他5種成分的洗脫率基本不變，而苯甲酸為負(fù)向成分，苯甲酰芍藥苷的含量遠(yuǎn)低于芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷，因此，為了盡量提高芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷的洗脫率并適當(dāng)降低成本，選擇了50%乙醇進(jìn)行洗脫。文獻(xiàn)中白芍提取物的純化工藝中，通常以芍藥苷轉(zhuǎn)移率、白芍總苷轉(zhuǎn)移率、浸膏得率等因素作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，所得的最優(yōu)純化條件，柱徑高比為1∶7～1∶10，上樣液質(zhì)量濃度大部分為0.5 g/mL，也有0.1、0.2、1.0 g/mL；上樣體積流量為2.4～5 BV/h，洗脫體積流量為2～7 BV/h，也有文獻(xiàn)以滴/s作為體積流量單位，換算后上樣體積流量和洗脫體積流量分別為9、18 BV/h，和其他文獻(xiàn)差異過(guò)大。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，體積流量的調(diào)節(jié)較難控制，且隨著溶液流出，體積流量逐漸減小，這可能是造成最優(yōu)體積流量差異的原因之一。除此之外，部分文獻(xiàn)中將提取液進(jìn)行離心處理后再進(jìn)行純化，也可能是造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異的原因。

芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷為白芍提取物中含量最高的2種有效成分，兩者為同分異構(gòu)體。有關(guān)芍藥苷穩(wěn)定性的研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷在大于80 ℃、偏堿性環(huán)境、水液中、光照情況下可發(fā)生降解[25-27]，同時(shí)芍藥苷的半縮酮結(jié)構(gòu)可與溶劑中的乙醇發(fā)生縮酮反應(yīng)導(dǎo)致降解[28]。本研究提取用溶劑為50%乙醇，沸點(diǎn)高于80 ℃，盡管減壓回收中溫度控制在60 ℃以下，水液不偏堿性，也可能存在芍藥苷分解。另有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)加熱炮制后的白芍中的芍藥內(nèi)酯苷含量高于生品[29]，與本實(shí)驗(yàn)中芍藥苷轉(zhuǎn)移率偏低，芍藥內(nèi)酯苷轉(zhuǎn)移率較高甚至超過(guò)100%的現(xiàn)象類似。芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在一定條件下可相互轉(zhuǎn)化[30]，課題組前期測(cè)定白芍花中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量時(shí)，發(fā)現(xiàn)在3個(gè)品種的白芍花中均存在芍藥苷含量鮮花中高，干燥花中降低而芍藥內(nèi)酯苷升高的現(xiàn)象[31]，認(rèn)為溫度升高可能會(huì)促進(jìn)芍藥苷轉(zhuǎn)化為芍藥內(nèi)酯苷，因此應(yīng)將2種成分的轉(zhuǎn)移率合并判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如將目前得到的優(yōu)化工藝中純化后超出原藥材含量的芍藥內(nèi)酯苷視為芍藥苷轉(zhuǎn)化而來(lái)，則可計(jì)算出芍藥苷轉(zhuǎn)移率應(yīng)大于71.70%。

總之，本研究?jī)?yōu)化的從芍頭中提取總單萜苷有效部位的制備工藝較穩(wěn)定、可行，為白芍非藥用部位的開(kāi)發(fā)提供了參考，降低了白芍單萜苷有效部位提取原料的成本，提高了藥農(nóng)收入，有利于綠色中藥種植的可持續(xù)發(fā)展。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on preparation of monoterphene glycosides from the non-medicinal part-rhizome of

MA Zhe, XIE Kai-li, GONG Mu-xin

School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100069, China

To optimize the extraction and purification process of active parts of monoterpene glycosides from the non-medicinal part-rhizome of.The contents of multiple components were used as indexes, including monoterpenoid glycosides, such as paeoniflorin and albiflorin, and non-monoterphene glycosides components, such as benzoic acid and gallic acid. The normalization method was used to obtain the overall desirability (OD). The extraction time, solid-to-liquid ratio and ethanol volume fraction, as the key process parameters, were optimized through central composite design-response surface methodology, and the results were verified. Based on the single factor tests used to determine the type of macroporous resin, the loading volume flow rate, loading solution mass concentration, column diameter to height ratio, and elution volume flow rate were the key process parameters for purification. Orthogonal design experiments that can investigate the interactions were used to optimize the extraction liquid purification process and the results were verified.The optimal reflux extraction process of rhizome ofwas to extract twice with 12 times of 50% ethanol, 80 minutes eachtime. The OD values of three validation experiment were 2.61, 2.49, 2.57, and the RSD was 2.5%. D-101 macroporous adsorption resin was selected for the purification, 0.25 g/mL drug solution was loaded, the sample volume flow rate was 0.5 mL/min, the diameter-to-height ratio was 1: 4, the maximum sample load was 3 BV, 2 BV deionized water was used for impurity removal, and 4 BV 50% ethanol was eluted at the volume flow rate of 1 mL/min. The comprehensive scores of the three purification process verifications were 0.733 3, 0.702 4, 0.729 7, the RSD was 2.3%, and the total transfer rate of monoterpene glycosides was 74.17%, and the mass fraction of monoterpene glycosides in the purified product was 59.85%.The optimum extraction process is efficient and steady, which can remove most of non-monoterpene glycosides in the rhizome of, and obtain the active fraction of the monoterpene glycosides in the rhizome of.

rhizome ofPall.; central composite design-response surface methodology; extraction process; purification process; macroporous resin; monoterpene glycosides;gallic acid;oxypaeoniflorin;albiflorin;paeoniflorin; galloylpaeoniflorin; benzoic acid;benzoylpaeoniflorin;overall desirability

R284.2

A

0253 - 2670(2021)02 - 0386 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.02.011

2020-08-23

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFC1701903-3）

馬 喆（1997—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴帉W(xué)。E-mail: 1144938549@qq.com

龔慕辛（1968—），女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥制劑工藝與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Tel: (010)83911624 E-mail: gongmuxin@126.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]