吳賢建,路 遠(yuǎn)，石 鳳，王安民，張 亞，浦 澗

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，廣西 百色 533000)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌類(lèi)型，也是全球第六大最常見(jiàn)的癌癥[1]。肝癌被認(rèn)為是導(dǎo)致癌癥死亡的第二大原因，全世界每年有700 000多例肝癌死亡[2]。早期肝癌患者通常沒(méi)有任何癥狀，大多數(shù)肝癌患者在晚期被診斷出來(lái)，因此預(yù)后較差，5年總生存率低于10%[3]。HCC腫瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制尚未完全了解，揭示這些問(wèn)題有助于開(kāi)發(fā)HCC的新診斷與治療方法。

長(zhǎng)的非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非蛋白質(zhì)編碼RNA[4]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，lncRNA參與了許多基因調(diào)控的基本過(guò)程，包括對(duì)miRNA功能的調(diào)節(jié)[5-7]，直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控[8]，基因沉默和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾[9]。lncRNA在許多腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[10-12]。CTD-2510F5.4 是最近被發(fā)現(xiàn)在肺癌[13]與胃癌[14]中顯著高表達(dá)的lncRNA，但CTD-2510F5.4在肝癌中的研究未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析、沉默試驗(yàn)，檢測(cè)CTD-2510F5.4沉默對(duì)體外Huh-7肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡及RACGAP1的表達(dá)的影響，以探討CTD-2510F5.4在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要儀器

Huh-7人肝癌細(xì)胞購(gòu)自上海生科院，RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，CCK8試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司(FC101-03)，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司(SH30022.01), lipo 3000購(gòu)自Thermo Fisher公司(貨號(hào)：L3000015)，胎牛血清購(gòu)自Gibco(42F7180K)，Annexin V-PE/7-AAD雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Biolegend公司(640934)，遷移小室購(gòu)自Coring公司(3422)，基質(zhì)膠購(gòu)自Coring公司(貨號(hào)：354248)， CTD-2510F5.4 siRNA與陰性對(duì)照載體購(gòu)自湖州河馬生物科技有限公司，序列：5'-GCAATATAGCAAGACACTGACTCTA-3'， RACGAP1抗體(ab2270)與actin抗體(ab8226)購(gòu)自abcam公司。

CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo Fisher公司(3111)，流式細(xì)胞儀購(gòu)自BECKMAN公司(CogtoFLEX)，倒置熒光顯微鏡購(gòu)自尼康公(DS-Fi3)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析 本研究采用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中肝癌(Liver hepatocellular carcinoma，LIHC)進(jìn)行分析，其中肝癌樣本369例，正常樣本50例。針對(duì)肝癌與正常樣本中 CTD-2510F5.4與RACGAP1表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并統(tǒng)計(jì)CTD-2510F5.4與RACGAP1表達(dá)相關(guān)性。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 Huh-7人肝癌細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃；胰酶消化后制成懸液，接種在細(xì)胞板中并進(jìn)行后續(xù)處理。設(shè)計(jì)分組：CTD-2510F5.4沉默組與陰性載體對(duì)照組，使用lipo 3000將CTD-2510F5.4 siRNA和空載對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.3RT-PCR檢測(cè) 各組處理后的細(xì)胞，加入20倍體積的TRIzol試劑進(jìn)行裂解，用一次性注射器反復(fù)抽打細(xì)胞使得裂解充分，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用熒光定量PCR儀器進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)計(jì)CTD-2510F5.4引物：GAPDH上游引物：5′- CCAGGTGGTCTCCTCTGA -3′，下游引物5′-GCTGTAGCCAAATCGTTGT-3′，RACGAP1上游引物：5′-AAGAGGTCTGACTGAGACAG-3′,下游引物：5′-GAAGGCTACAGATAGCATGG-3′采用2-ΔΔct法比較組間表達(dá)。

1.2.4CCK8檢測(cè) 胰蛋白酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)并以每孔中接種5×103個(gè)細(xì)胞，接種到96孔板中，每組3個(gè)重復(fù)。將包含CCK8試劑的100 μL培養(yǎng)基添加到每個(gè)孔中，并孵育4 h，吸出培養(yǎng)基，并添加150 μL二甲基亞砜以溶解，后將細(xì)胞置于酶標(biāo)儀上，讀取450 nm處的吸光值。

1.2.5流式檢測(cè)凋亡 轉(zhuǎn)染后的Huh-7細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔重復(fù)，1 500 r/min離心5 min后棄去上清，PBS 洗滌后重懸細(xì)胞，取細(xì)胞懸液 100 μL，加入5 mL Annexin V-7AAD染料進(jìn)行染色15 min，后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6Transwell檢測(cè)侵襲 無(wú)血清培養(yǎng)基重懸轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，加500 μL的含有10% FBS的培養(yǎng)基至下室，加300 μL已調(diào)節(jié)好細(xì)胞密度的細(xì)胞懸液(5×104個(gè))至侵襲小室內(nèi)；置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出小室，用4%多聚甲醛固定20 min，加500 μL結(jié)晶紫染色10 min，PBS沖洗100倍顯微鏡拍照。

1.2.7Western blot檢測(cè) 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，在具有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液中裂解，通過(guò)8%的SDS-PAGE凝膠電泳分離總蛋白。將蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，并用5%脫脂牛奶封閉。然后將膜與一抗(RACGAP1或actin)孵育過(guò)夜，然后與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的第二抗體孵育。用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析

通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中肝癌與正常樣本進(jìn)行分析，CTD-2510F5.4在肝癌樣本中顯著高表達(dá),見(jiàn)圖1A;RACGAP1在肝癌樣本中顯著高表達(dá),見(jiàn)圖1B;CTD-2510F5.4與RACGAP1在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)肝癌樣本中表達(dá)正相關(guān)(r=0.85)，見(jiàn)圖1C。

A: CTD-2510F5.4在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)肝癌與正常表達(dá)；B：RACGAP1在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)肝癌與正常表達(dá)；C：CTD-2510F5.4與RACGAP1在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)肝癌中表達(dá)相關(guān)性圖1 CTD-2510F5.4在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)肝癌中的表達(dá)及與RACGAP1表達(dá)的相關(guān)性分析Fig 1 CTD-2510F5.4 is specifically and highly expressed in liver cancer cases from TCGA database and is positively correlated with RACGAP1 expression

2.2 CTD-2510F5.4沉默驗(yàn)證與增殖檢測(cè)

轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率均在90%以上，見(jiàn)圖2A、2B。RT-PCR檢測(cè)沉默組(si-CTD-2510F5.4)與對(duì)照組(NC)中CTD-2510F5.4表達(dá)，沉默組中CTD-2510F5.4相對(duì)表達(dá)為0.260±0.025，明顯低于NC組中CTD-2510F5.4相對(duì)表達(dá)1.027±0.041(t=16.06，P<0.001)，沉默效率為76.7%，見(jiàn)圖2C。沉默后CCK8結(jié)果提示，沉默組相對(duì)NC組細(xì)胞增殖被抑制(t=20.02，P<0.001)，見(jiàn)圖2D。

A：轉(zhuǎn)染后Huh-7細(xì)胞(白光，100X)；B：轉(zhuǎn)染后Huh-7細(xì)胞(綠色熒光，100X)；C：RT-PCR驗(yàn)證沉默效率；D：CCK8檢測(cè)；與對(duì)照組比較，***P<0.001 vs. NC。圖2 CTD-2510F5.4沉默后抑制肝癌細(xì)胞增殖Fig 2 CTD-2510F5.4 inhibits the proliferation of liver cancer cells after silencing

2.3 CTD-2510F5.4沉默后促進(jìn)凋亡

采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CTD-2510F5.4沉默后凋亡變化，結(jié)果提示，沉默組(si- CTD-2510F5.4)凋亡率為(7.243±0.049)%，明顯高于對(duì)照組(NC)的凋亡率(3.113±0.139)%(t=28.09，P<0.001),見(jiàn)圖3，提示CTD-2510F5.4沉默可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞Huh-7細(xì)胞凋亡。

A：NC組；B：si-CTD-2510F5.4組；C：凋亡率統(tǒng)計(jì)圖；與對(duì)照組比較，***P<0.001 vs. NC。圖3 CTD-2510F5.4沉默后促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡Fig 3 CTD-2510F5.4 silencing promotes apoptosis of liver cancer cells

2.4 CTD-2510F5.4沉默后抑制侵襲

采用Transwell檢測(cè)CTD-2510F5.4沉默后侵襲變化，結(jié)果提示，CTD-2510F5.4沉默組遷移細(xì)胞為(104.0±5.196)個(gè)，明顯低于對(duì)照組(200.6±6.269)個(gè)(t=11.86，P=0.000 3)，見(jiàn)圖4，提示CTD-2510F5.4沉默可以抑制Huh-7肝癌細(xì)胞侵襲。

A：NC組；B：si-CTD-2510F5.4組；C：凋亡率統(tǒng)計(jì)圖，拍攝倍數(shù) 100×；***P<0.001 vs. NC。圖4 CTD-2510F5.4沉默后抑制肝癌細(xì)胞侵襲Fig 4 CTD-2510F5.4 suppresses invasion of liver cancer cells after silencing.

2.5 CTD-2510F5.4沉默后抑制RACGAP1表達(dá)

為探討CTD-2510F5.4對(duì)增殖侵襲的可能機(jī)制，CTD-2510F5.4沉默后采用RT-PCR與Western blot檢測(cè)RACGAP1表達(dá)影響。結(jié)果顯示，CTD-2510F5.4沉默組中RACGAP mRNA相對(duì)表達(dá)為0.236±0.023，明顯低于對(duì)照組中的1.006±0.075 2(t=9.799，P=0.006)，見(jiàn)圖5A，沉默組中RACGAP蛋白相對(duì)表達(dá)為0.591±0.020，明顯低于對(duì)照組的0.934±0.088(t=3.789，P=0.019 3)，見(jiàn)圖5B、5C。提示，CTD-2510F5.4沉默后抑制RACGAP1 mRNA與蛋白表達(dá)。

A：RACGAP1 mRNA表達(dá)；B:RACGAP1蛋白表達(dá)條帶；C：RACGAP1蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖;*P<0.05,***P<0.001 vs. NC。圖5 CTD-2510F5.4沉默后抑制RACGAP1表達(dá)Fig 5 CTD-2510F5.4 inhibits RACGAP1 expression after silencing

3 討論

肝細(xì)胞癌是人類(lèi)最普遍和最具侵略性的惡性腫瘤之一[15]。盡管目前使用了各種治療方法，HCC的臨床預(yù)后仍然很差，尤其是在這些具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或晚期腫瘤的HCC患者中[16]。缺乏適用于HCC診斷和治療的分子標(biāo)記是早期診斷率低及臨床預(yù)后差的主要原因[17]。迫切需要更好地理解與評(píng)估肝癌的發(fā)病，以開(kāi)發(fā)更具療效的靶標(biāo)療法。

近年來(lái)，lncRNA在肝癌中重要作用已有較多報(bào)道[18-20]。在胃癌[14]中，CTD-2510F5.4是一種與惡性表型相關(guān)的lncRNA。但CTD-2510F5.4在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚未見(jiàn)研究報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA CTD-2510F5.4在肝癌高表達(dá)。沉默試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默CTD-2510F5.4能抑制Huh-7人肝癌細(xì)胞增殖及侵襲，并促進(jìn)凋亡。提示，lncRNA CTD-2510F5.4可能是肝癌的致癌lncRNA。

RACGAP1是Rac GTPase激活蛋白1，可以負(fù)調(diào)控Rho蛋白[21]，已被報(bào)道在多種腫瘤中具有重要作用[22, 23]。RACGAP1在肝癌中異常上調(diào)與肝癌的不良預(yù)后相關(guān)[24]。但CTD-2510F5.4與RACGAP1是否存在調(diào)控關(guān)系，目前尚不清楚。筆者對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)研究及對(duì)CTD-2510F5.4沉默研究表明，lncRNA CTD-2510F5.4與RACGAP1表達(dá)呈正相關(guān)；抑制lncRNA CTD-2510F5.4可導(dǎo)致Huh-7人肝癌細(xì)胞的RACGAP1 mRNA與蛋白表達(dá)降低，提示RACGAP1可能是lncRNA CTD-2510F5.4的作用靶點(diǎn)。但lncRNA CTD-2510F5.4是否通過(guò)或如何通過(guò)RACGAP1影響肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲及凋亡，尚需后續(xù)的進(jìn)一步試驗(yàn)論證。

總之，本研究表明沉默lncRNA CTD-2510F5.4能抑制Huh-7人肝癌細(xì)胞增殖、侵襲，促進(jìn)凋亡，并抑制RACGAP1表達(dá)。推測(cè)lncRNA CTD-2510F5.4可能是肝癌的致癌lncRNA，RACGAP1可能是lncRNA CTD-2510F5.4的作用靶點(diǎn)。這為進(jìn)一步理解肝癌發(fā)病機(jī)制與開(kāi)發(fā)診斷指標(biāo)提供了參考。